Giardia duodenum ialah organisma parasit yang menyebabkan giardiasis, jangkitan usus terutamanya biasa pada kanak-kanak kecil dengan tanda-tanda klinikal cirit-birit.Kami sebelum ini telah melaporkan bahawa G. duodenalis ekstraselular mencetuskan pengaktifan nukleotida pengikat seperti reseptor oligomerisasi intraselular 3 (NLRP3) dan mengawal tindak balas keradangan perumah melalui rembesan vesikel ekstraselular (EV).Walau bagaimanapun, corak molekul yang tepat bagi EV duodenokokus berkaitan patogen (GEV) yang terlibat dalam proses ini dan peranan keradangan NLRP3 dalam giardiasis masih belum dijelaskan.
Plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 giardins dalam GEV telah dibina, ditransfeksi ke dalam makrofaj peritoneal primer tikus, dan dikesan dengan mengukur molekul sasaran keradangan caspase-1.Tahap ekspresi p20 telah disaring..G. duodenalis alpha-2 dan alpha-7.3 giardines pada asalnya dikenal pasti dengan mengukur inflammasom NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 dan caspase-1 p20), rembesan IL.Tahap 1β, tahap oligomerisasi protein berbintik apoptosis (ASC), dan penyetempatan imunofluoresen NLRP3 dan ASC.Peranan inflammasom NLRP3 dalam patogenik G. duodenalis kemudian dinilai menggunakan tikus di mana pengaktifan NLRP3 telah disekat (tikus disekat NLRP3) dan perubahan patologi dalam berat badan, beban parasit duodenal, dan tisu duodenal dipantau.Di samping itu, kami menyiasat sama ada hiardin alpha-2 dan alpha-7.3 mendorong rembesan IL-1β dalam vivo melalui inflammasom NLRP3 dan menentukan peranan molekul ini dalam patogenik G. duodenalis pada tikus.
Alpha-2 dan alpha-7.3 giardine mendorong pengaktifan inflammasom NLRP3 secara in vitro.Ini membawa kepada pengaktifan p20 caspase-1, peningkatan tahap ekspresi NLRP3, pro-IL-1β, dan pro-caspase-1 protein, peningkatan ketara dalam rembesan IL-1β, pembentukan bintik ASA dalam sitoplasma, dan induksi oligomerisasi ASA.Keradangan NLRP3 Kehilangan zakar memburukkan lagi patogenik G. duodenalis pada tikus.Tikus yang dirawat dengan sista secara gavage daripada tikus yang disekat NLRP3 menunjukkan peningkatan bilangan trofozoit dan kerosakan teruk pada vili duodenal, yang dicirikan oleh crypt nekrotik dengan mengecut dan bercabang.Eksperimen in vivo telah menunjukkan bahawa giardine alpha-2 dan alpha-7.3 boleh mendorong rembesan IL-1β melalui inflammasom NLRP3, dan imunisasi dengan giardine alpha-2 dan alpha-7.3 mengurangkan patogenik G. duodenalis pada tikus.
Diambil bersama, hasil kajian ini mencadangkan bahawa giardia alpha-2 dan alpha-7.3 menyebabkan penyelarasan keradangan NLRP3 hos dan mengurangkan kejangkitan G. duodenalis pada tikus, yang merupakan sasaran yang menjanjikan untuk mencegah giardiasis.
Giardia duodenum adalah parasit protozoa ekstraselular yang hidup di dalam usus kecil dan menyebabkan 280 juta kes giardiasis dengan cirit-birit setiap tahun, terutamanya di kalangan kanak-kanak di negara membangun [1].Orang ramai dijangkiti dengan meminum air atau makanan yang tercemar dengan sista M. duodenum, yang kemudiannya memasuki perut dan dikumuhkan dalam jus gastrik.Giardia duodenum trophozoites melekat pada epitelium duodenum, menyebabkan loya, muntah, cirit-birit, sakit perut, dan penurunan berat badan.Individu yang mengalami kekurangan imun dan fibrosis kistik terdedah kepada jangkitan.Jangkitan juga boleh berlaku melalui seks oral dan dubur [2].Dadah seperti metronidazole, tinidazole, dan nitazoxanide adalah pilihan rawatan pilihan untuk jangkitan duodenal [3].Walau bagaimanapun, ubat kemoterapi ini menyebabkan kesan sampingan yang buruk seperti loya, karsinogenesis, dan genotoksisiti [4].Oleh itu, strategi yang lebih berkesan perlu dibangunkan untuk mencegah jangkitan G. duodenalis.
Inflammasom adalah kelas kompleks protein sitosol yang merupakan sebahagian daripada tindak balas imun semula jadi, membantu untuk mempertahankan diri daripada pencerobohan patogen dan mengantara tindak balas keradangan [5].Di antara inflammasom ini, nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasom telah dikaji secara meluas kerana ia boleh dikesan oleh pelbagai patogen/corak molekul/berkaitan kerosakan (PAMP). DAMP), mengenali, mengaktifkan sistem imun semula jadi.dan mengawal homeostasis usus dalam banyak penyakit radang [6,7,8].Ia terdiri daripada reseptor pengecaman corak (PRR) NLRP3, protein tompok apoptosis penyesuai (ASC), dan procaspase-1 atau procaspase-11.Inflammasom NLRP3 bertindak sebagai perumah terhadap pencerobohan patogen, seperti yang diperhatikan dalam Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], dan kajian Leishmania.[11], tetapi juga telah dilaporkan bahawa pengaktifan inflammasom NLRP3 mengehadkan tindak balas imun pelindung dan memburukkan lagi perkembangan penyakit, contohnya, dalam cacing [12].Berdasarkan penemuan kami sebelum ini, kami melaporkan bahawa ekstraselular G. duodenalis mencetuskan pengaktifan intraselular keradangan NLRP3 dan memodulasi tindak balas keradangan perumah dengan merembeskan vesikel ekstraselular (EVs) [13].Walau bagaimanapun, peranan inflammasom NLRP3 dalam jangkitan G. duodenalis in vivo masih belum ditentukan.
Giardins pada asalnya digambarkan sebagai komponen struktur sitoskeleton G. duodenalis dan memainkan peranan penting dalam motilitas trofozoit dan perlekatan sel epitelium dalam usus kecil.Untuk lebih menyesuaikan diri dengan persekitaran dan meningkatkan kepatogenannya, G. duodenalis trophozoites membangunkan struktur sitoskeletal unik yang terdiri daripada 8 flagella, 1 badan tengah, dan 1 cakera ventral [14].Trofozoit Giardia duodenum menggunakan sitoskeletonnya untuk menembusi usus kecil atas, terutamanya duodenum, dan melekat pada enterosit.Mereka sentiasa berhijrah dan melekat pada sel epitelium menggunakan metabolisme sel.Oleh itu, terdapat hubungan rapat antara sitoskeleton dan virulensi mereka.Giardine khusus untuk Giardia duodenum adalah komponen struktur sitoskeleton [15] dan dibahagikan kepada empat kelas: α-, β-, γ-, dan δ-giardines.Terdapat 21 ahli keluarga α-giardin, yang kesemuanya mempunyai keupayaan bergantung kepada kalsium untuk mengikat fosfolipid [16].Mereka juga menyambungkan sitoskeleton ke membran sel.Pada individu yang mengalami cirit-birit yang disebabkan oleh G. duodenalis, α-giardins sangat dinyatakan dan imunoreaktif semasa jangkitan [17].Vaksin heterolog berdasarkan Giardia alfa-1 dilindungi daripada giardiasis pada tikus dan merupakan antigen calon yang berpotensi untuk pembangunan vaksin [18].Alpha-8 giardin, disetempat dalam membran plasma dan flagella, tetapi tidak dalam cakera ventral, meningkatkan motilitas dan kadar pertumbuhan trofozoit dalam G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin melekat pada struktur microtubule pada flagela dan menjejaskan daya maju G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine hadir dengan banyaknya sepanjang kitaran hayat, dan ekspresi berlebihan alpha-11 giardine merosakkan G. duodenalis itu sendiri [21].Walau bagaimanapun, tidak jelas sama ada alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine adalah pelindung terhadap jangkitan G. duodenalis dan mekanisme asasnya.
Dalam kajian ini, plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine telah ditransfeksi ke dalam makrofaj peritoneal primer tikus untuk mengaktifkan hos NLRP3.Sasaran inflammasome kemudiannya disaring.Kami juga menilai peranan inflammasom NLRP3 dalam patogenik G. duodenalis, menyiasat sama ada alpha-2 dan alpha-7,3 giardines mendorong pengaktifan inflammasom NLRP3 dalam vivo, dan menentukan bahawa kedua-dua peranan giardin ini dalam patogenik G. duodenalis.Matlamat bersama kami adalah untuk membangunkan sasaran yang menjanjikan untuk pencegahan jangkitan G. duodenalis.
Tikus betina jenis liar (WT) C57BL/6 berumur 5-8 minggu telah dibeli dari Pusat Haiwan Eksperimen Liaoning Changsheng (Liaoning, China).Tikus mempunyai akses percuma kepada air, menerima makanan yang disterilkan dan disimpan dalam kitaran terang/gelap 12/12 jam.Sebelum jangkitan, tikus menerima antibiotik ad libitum dalam air minuman yang ditambah dengan ampicillin (1 mg/mL), vankomisin (1 mg/mL), dan neomycin (1.4 mg/mL) (semuanya dibeli dari Shanghai, China, organisma tiruan) [22 ].].Tikus yang kehilangan keupayaan untuk makan dan minum selama > 24 jam dan kehilangan ≥ 20% berat badan telah dimusnahkan secara manusiawi oleh dislokasi serviks.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) telah ditambah dengan 12.5% ​​​​serum lembu janin (FBS; Every Green, Zhejiang, China) dan 0.1% hempedu lembu (Sigma-Aldrich, St. Missouri, Amerika Syarikat). ).USA) di bawah keadaan mikroaerobik.Trofozoit konfluen dikumpul di atas ais dan disalurkan pada nisbah 1:4 untuk pembiakan selanjutnya.
Sista duodenum Giardia telah diinduksi seperti yang diterangkan sebelum ini [23], trofozoit dituai dalam fasa logaritma dan kemudian dicairkan dengan medium induksi enkapsulasi, pH 7.1 (TYI-S-33 yang diubah suai) kepada kepekatan akhir 1 × 106 trophozoit/mL.kepekatan hempedu 0.05% sederhana).Trophozoit dibiakkan dalam keadaan anaerobik pada 37°C sehingga fasa pertumbuhan logaritma.Tukar medium kepada medium induksi sista (pH 7.8; medium TYI-S-33 diubah suai dengan kepekatan hempedu 1%) dan kultur G. duodenalis pada 37°C selama 48–96 jam, di mana sista pembentukan diperhatikan di bawah mikroskop.Selepas kebanyakan trofozoit telah diinduksi untuk membentuk sista, campuran kultur telah dituai dan digantung semula dalam air ternyahion steril untuk melisiskan baki trofozoit.Sista dikira dan disimpan pada suhu 4 ° C untuk analisis seterusnya melalui tiub gastrik pada tikus.
Vesikel ekstraselular Giardia (GEV) telah diperkaya seperti yang diterangkan sebelum ini [13].Trofozoit dalam fasa pertumbuhan logaritma telah digantung semula dalam medium TYI-S-33 yang diubah suai yang disediakan dengan FBS yang habis eksosom (Industri Biologi, Beit-Haemek, Israel) kepada kepekatan akhir 1 × 106 parasit/mL dan diinkubasi selama 12 jam.telah diasingkan daripada supernatan kultur dengan sentrifugasi pada 2000 g selama 10 minit, 10,000 g selama 45 minit, dan 100,000 g selama 60 minit.Mendakan telah dilarutkan dalam garam terbuffer fosfat (PBS), dikira menggunakan kit ujian protein BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan disimpan pada -80° C. atau digunakan terus untuk analisis lanjut.
Makrofaj peritoneal tetikus utama telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini [24].Secara ringkas, tikus (berumur 6-8 minggu) disuntik (intraperitoneally [ip]) dengan 2.5 ml 2.98% medium thioglycol cecair Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) dan diberi makan 3-4 lelangit.Penggantungan makrofaj dikumpulkan dari rongga perut tikus selepas euthanasia dan disentrifugasi 3 kali pada 1000 g selama 10 minit.Sel yang dituai dikesan oleh sitometri aliran menggunakan penanda CD11b sehingga ketulenan sel adalah> 98%, kemudian ditambah kepada plat kultur sel 6-telaga (4.5 x 106 sel/telaga) dan diinkubasi dengan 10% FBS (Bioindustri) pada 37°C.dan 5% CO2.
RNA diekstrak daripada 1 × 107 trofozoit dalam 1 ml reagen TRIzol (Vazyme, Nanjing, China), DNA genomik diekstrak daripada jumlah RNA G. duodenalis menggunakan MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) dan DNA pelengkap (cDNA) telah disintesis menggunakan MonScript RTIIII Super Mix (Monad) mengikut arahan pengilang.
Maklumat jujukan CDS untuk gen sasaran G. duodenalis diperoleh daripada NCBI GenBank.Gunakan Primer 5.0 untuk mereka bentuk primer pengklonan lancar khusus untuk setiap gen sasaran.Primer hadapan (5′-3′) terdiri daripada tiga bahagian: urutan bertindih dengan vektor linear pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTTCTGCAGAT) dan mulakan kodon ATG dan GNN (jika asas pertama bukan G).Ini dilakukan untuk meningkatkan kecekapan ungkapan.Selain itu, sekurang-kurangnya 16 bp bes gabungan (kandungan GC 40–60%/Tm lebih kurang 55 °C).Primer terbalik (5'-3') terdiri daripada dua bahagian, urutan bertindih dengan vektor pcDNA3.1(+) EcoRV-linearized (GCCGCCACTGTGCTGGAT) dan asas gabungan sekurang-kurangnya 16 bp.(tidak termasuk dua perhentian terakhir).bes) kodon seperti AA atau GA untuk membenarkan plasmid rekombinan menyatakan protein berlabelnya).Urutan primer disenaraikan dalam Jadual 1 dan telah disintesis oleh Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Sasaran telah dikuatkan menggunakan Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) atau Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) menggunakan G. duodenalis cDNA yang disediakan sebagai templat.Plasmid vektor ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+) telah dilinearkan dengan enzim sekatan EcoRV dan dinyahfosforilasi menggunakan Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Serpihan pcDNA3.1(+) linearized dan serpihan gen sasaran yang diperkuat telah disucikan menggunakan kit penulenan gel DNA (Tiangen) dan dikira menggunakan Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Serpihan pcDNA3.1(+) dan setiap serpihan gen sasaran digabungkan semula menggunakan campuran pengklonan pemasangan tunggal MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) dan disahkan oleh penjujukan DNA menggunakan Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) ..
Plasmid bebas endotoksin pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 dijana menggunakan Kit Mini Plasmid tanpa Endotoksin SanPrep (Sangon Biotech).Kepekatan dikekalkan melebihi 500 ng/µl untuk memastikan bahawa EDTA dalam penimbal elusi tidak mengganggu ujian transfeksi.Makrofaj peritoneal tetikus utama dibiakkan dalam plat 6-telaga dengan medium RPMI 1640 lengkap (Industri Biologi) selama 12 jam, kemudian sel-sel itu dibasuh 3 kali dalam PBS hangat untuk mengeluarkan penisilin dan streptomisin, dan kemudian dalam medium ditambah dengan medium lengkap.Plasmid bebas endotoksin pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) telah dicairkan dalam 125 μl medium serum terkurang Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific) ..Kemudian 5 µl Lipofectamine 2000 reagen transfection (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) dicairkan dalam 125 µl medium Opti-MEM serum rendah.Sediakan kompleks liposom-DNA dengan mencampurkan plasmid bebas endotoksin yang dicairkan dengan Lipofectamine 2000 dan membenarkan campuran itu berdiri pada suhu bilik selama 5 minit.Pindahkan kompleks secara berasingan ke sel dalam setiap perigi dan gaul perlahan-lahan.Selepas 4 jam, medium kultur sel digantikan dengan 2 ml medium RPMI 1640 lengkap dan kultur diteruskan selama 24 jam.Medium kultur sel segar telah ditambah ke dalam sel dan diinkubasi untuk pelbagai titik masa bergantung kepada reka bentuk ujian.
Sampel protein daripada supernatan dan lisat sel telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini [25].Parameter pemindahan membran untuk pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin dan His-tag ialah 200 mA/90 min.Untuk interleukin 1β (IL-1β; Sistem R&D, Minneapolis, Minnesota, Amerika Syarikat), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) dan NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) dan 1:5000 menyasarkan tegnya ( Amylet Scientific, Wuhan, China) dan β-actin (Proteintech, Wuhan, China).
Pautan silang dengan disuccinimide suberate (DSS) telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [26].Sel telah dibasuh 3 kali dengan PBS sejuk dan dilisiskan sepenuhnya dengan jarum tolok 27 dalam penimbal tindak balas ASC 50 µl (pH 8.0) yang mengandungi 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES dan 125 mM NaHCO3.Campuran telah disentrifugasi pada 5000 g selama 3 minit dan pelet dijahit dengan 10 µl DSS (25 mM dalam DMSO) dan 40 µl penimbal tindak balas ASC selama 30 minit pada 37°C.Selepas sentrifugasi pada 5000 g selama 10 minit, pelet telah dibubarkan dalam larutan 40 µl penimbal tindak balas ASC dan 10 µl penimbal pemuatan protein 6x (TransGen, Beijing, China), dan kemudian larutan itu dipadamkan pada suhu bilik selama 15 min., Kemudian rebus 10 minit.Sampel protein kemudiannya tertakluk kepada Western blotting menggunakan antibodi anti-ASC primer (Wanleibio, Shenyang, China) pada nisbah pencairan 1:500.
Berikutan prosedur yang diterangkan sebelum ini [13], supernatan kultur sel telah dituai dan rembesan sitokin pro-radang IL-1β ditentukan menggunakan kit IL-1 Beta ELISA tetikus (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Tukar nilai OD450nm kepada kepekatan protein menggunakan lengkung piawai IL-1β.
Sel-sel yang disalut pada slip penutup dibasuh perlahan-lahan 3 kali dalam PBS hangat, difiksasi dalam penetapan sel tisu (Biosharp, Beijing, China) selama 10 minit pada suhu bilik (RT), dalam 0.1% Triton X-Permeabilize pada 100 (dicairkan dalam PBS; Biosharp ) selama 20 minit pada suhu bilik dan sekat dalam 5% albumin serum lembu (dalam PBS) selama 2 jam pada suhu bilik.Sel kemudiannya diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi utama terhadap ASC (pencairan 1:100) atau NLRP3 (pencairan 1:100), masing-masing, dan kambing berlabel Cy3 anti-arnab IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) atau IgG anti-tikus kambing konjugat FITC (1:400; Earthox) semalaman pada suhu 37°C dalam gelap selama 1 jam.Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, China) selama 5 minit dan diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor (Olympus Corporation, Tokyo, Jepun).
Tikus dibahagikan kepada empat kumpulan (n = 7 dalam setiap kumpulan): (i) Kumpulan kawalan negatif yang dirawat PBS (PBS sahaja; gavage 100 µl/tetikus PBS diikuti dengan suntikan intraperitoneal harian 100 µl/tetikus PBS 3 jam kemudian) ., berterusan selama 7 hari);(ii) kumpulan kawalan negatif yang dirawat dengan perencat MCC950 [27] (100 µl/tikus melalui gavage PBS, 3 jam kemudian, 10 mg/kg berat badan [BW] MCC950 [dalam PBS] ditadbir secara intraperitoneal setiap hari, tempoh 7 hari);(iii) Kumpulan jangkitan sista G. duodenalis (1.5 x 106 sista/tikus secara gavage, 3 jam kemudian, 100 μl/tikus PBS intraperitoneal diberikan setiap hari selama 7 hari);(iv) G. duodenalis cyst kumpulan jangkitan gabungan kumpulan rawatan perencat MCC950 (1.5×106 sista/tikus melalui gavage, 10mg/kg berat badan MCC950 intraperitoneal setiap hari selama 7 hari pada 3j).Berat badan setiap tetikus dipantau setiap hari dan semua tikus dimatikan pada hari ke-7.Duodenum yang dituai (3 cm panjang) dipotong menjadi kepingan kecil dalam 1 ml PBS, sista dimusnahkan semalaman dalam PBS pada suhu 4°C, dan G. duodenalis trophozoites.Duodenum segar (1 cm panjang) telah diasingkan untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E).
Tikus dibahagikan kepada dua kumpulan: (i) kumpulan kawalan MOCK dan (ii) kumpulan perencat MCC950.Terdapat lima rawatan dalam setiap kumpulan (n = 7/kumpulan rawatan): (i) Kumpulan kawalan negatif rawatan PBS (PBS sahaja; 100 µl/tikus PBS, suntikan intramuskular (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) kumpulan kawalan negatif plasmid (100 µg/DNA tikus, melalui suntikan intramuskular) (iii) kumpulan kawalan positif jangkitan sista G. duodenalis (1.5 x 106 sista/tikus, melalui gavage) (iv) a kumpulan yang dirawat dengan plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/tetikus DNA, melalui suntikan intramuskular), dan (v) kumpulan yang dirawat dengan plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/tikus DNA, selepas 12 jam berlalu, tikus dalam kumpulan perencat MCC950 menerima suntikan intraperitoneal harian MCC950 (10 mg/kg berat badan) selama 7 hari, manakala tikus dalam kumpulan MOCK menerima jumlah rawatan PBS yang sama. Sampel darah adalah yang dikumpul daripada tikus bebola mata dan dibiarkan semalaman pada suhu 4 °C sampel Serum telah diasingkan menggunakan ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA) untuk dan pengukuran tahap IL-1β.
Tiga puluh lima tikus dibahagikan kepada lima kumpulan (n=7/kumpulan).Kumpulan 1 adalah kumpulan kawalan negatif yang dirawat dengan PBS: tikus menerima 100 μl PBS secara intramuskular dan 3 hari kemudian dengan gavage.Kumpulan 2 ialah kumpulan kawalan positif yang dijangkiti sista G. duodenalis: tikus disuntik dengan 100 μl PBS, dan 3 hari kemudian 1.5 x 106 sista/tikus disuntik secara intragastrik.Kumpulan ketiga – imunisasi plasmid dengan pcDNA3.1(+) dalam kombinasi dengan kumpulan kawalan untuk jangkitan sista duodenal: tikus menerima 100 μg DNA plasmid pcDNA3.1(+)(im) secara lisan, 1.5×106 sista/tikus 3 untuk beberapa hari.Kumpulan 4 dan 5 ialah plasmid giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 rekombinan atau pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 plasmid giardine dalam kombinasi dengan jangkitan sista G. duodenalis.Kumpulan eksperimen: tikus menerima 100 µg pcDNA3.DNA plasmid 1(+)-giardine (im), kemudian 3 hari kemudian, 1.5 × 106 sista/tikus disuntik melalui gavage.Berat badan setiap tetikus dipantau selepas pengenalan sista G. duodenalis melalui tiub.Duodenum segar dikumpul untuk pengukuran beban parasit dan analisis pewarnaan HE.
Perubahan histopatologi dianalisis mengikut prosedur yang diterbitkan sebelum ini [30].Duodenum segar difiksasi dengan fiksatif sel tisu, tertanam dalam parafin, dipotong kepada bahagian 4 μm, diwarnai dengan H&E dan dianalisis di bawah mikroskop cahaya.Perubahan patologi yang mewakili dalam tujuh bahagian tisu daripada tujuh tikus bebas dinilai oleh ahli patologi yang tidak mengetahui rawatan dan ditangkap pada pembesaran 200x.Panjang villi dan kedalaman crypts diukur mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini.
Keputusan in vitro dan in vivo diperolehi dalam tiga kali ganda.Graf dijana menggunakan GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Perbezaan antara dua kumpulan dianalisis dengan ujian-t, manakala perbezaan antara ≥3 kumpulan dianalisis dengan analisis varians sehala (ANOVA) menggunakan perisian SPSS (versi 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data dianalisis untuk kehomogenan varians menggunakan ujian Levene diikuti dengan ujian post hoc Bonferroni (B).Kepentingan dinyatakan sebagai P<0.05, P<0.01, dan P<0.001 (tidak signifikan [ns]) (P>0.05).
Analisis sebelumnya terhadap proteomik GEV dalam Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto (KEGG) menunjukkan bahawa banyak sasaran mungkin terlibat dalam pengaktifan laluan isyarat keradangan [13].Kami memilih dua sasaran yang menjanjikan, alpha-2 dan alpha-7.3 giardins, menguatkan molekul ini dan menggunakannya untuk membina vektor ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+).Selepas penjujukan, plasmid ekspresi pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 giardine rekombinan telah dipindahkan ke dalam makrofaj peritoneal tetikus primer, dan protein tandatangan caspase-1 p20 keradangan (serpihan caspase-1 yang diaktifkan) telah dikenal pasti. sebagai menjelaskan molekul utama yang boleh mencetuskan keradangan.Keputusan menunjukkan bahawa alpha-2 dan alpha-7.3 giardines boleh mendorong ekspresi p20 caspase-1 yang serupa dengan GEV.Tiada kesan ke atas pengaktifan caspase-1 ditemui dalam kawalan negatif yang tidak dirawat (PBS sahaja) dan kawalan plasmid pcDNA3.1(+) (Rajah 1).
Pengukuran pengaktifan p20 caspase-1 oleh pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 giardins.Plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 giardines (di atas setiap lorong) telah dipindahkan ke makrofaj peritoneal tetikus primer dan supernatan kultur dituai 24 jam kemudian.Western blotting digunakan untuk mengukur tahap ekspresi protein inflammasom caspase-1 p20 tandatangan.Kumpulan rawatan PBS sahaja (lorong C) dan kumpulan monoterapi pcDNA3.1(+) (lorong pcDNA3.1) digunakan sebagai kawalan negatif, dan kumpulan rawatan GEV digunakan sebagai kawalan positif.Ekspresi protein rekombinan telah disahkan dengan mengesan tag histidine dalam setiap protein, dan jalur protein yang dijangkakan ialah alpha-2 giardine (38.2 kDa) dan alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum vesikel ekstraselular, pcDNA3.1(+), vektor terlinear EcoRV, SUP, supernatan
Untuk menentukan sama ada alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine mendorong ekspresi p20 caspase-1 dan memainkan peranan dalam mengaktifkan tindak balas keradangan NLRP3 hos, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine dan pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin telah dipindahkan ke makrofaj peritoneal tetikus primer dengan DNA plasmid rekombinan, dan tahap ekspresi, penyetempatan, dan oligomerisasi protein keradangan utama NLRP3 telah ditentukan.Dalam eksperimen ini, GEV digunakan sebagai kumpulan kawalan positif, dan kumpulan tiada rawatan (PBS sahaja) atau kumpulan rawatan transfeksi pcDNA3.1(+) ialah kumpulan negatif.Keputusan menunjukkan bahawa, seperti dalam kumpulan GEV, DNA plasmid rekombinan giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 menghasilkan regulasi NLRP3, pro-IL-1β dan pengaktifan procaspase-1 dan caspase-1 (Rajah 2a).Di samping itu, kedua-dua giardine menyebabkan rembesan IL-1β yang ketara (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Rajah 2b).Kebanyakan protein ASC adalah monomerik dalam kumpulan tanpa rawatan atau dalam kumpulan rawatan yang ditransfeksi dengan pcDNA3.1(+) plasmid, berbeza dengan pcDNA3.1(+)-alpha-2 atau pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardine.Oligomerisasi ASC berlaku dalam DNA plasmid rekombinan kumpulan atau kumpulan kawalan positif GEV, menunjukkan bentuk oligomerik (Rajah 2c).Data awal ini mencadangkan bahawa alpha-2 giardine dan alpha-7,3 giardine boleh mendorong pengaktifan keradangan NLRP3.Kajian imunofluoresen berikutnya mengenai penyetempatan ASC dan NLRP3 menunjukkan bahawa dalam kumpulan kawalan negatif, protein ASC tersebar di seluruh sitoplasma dan muncul sebagai isyarat titik apabila rangsangan pcDNA3.1(+)-alpha-2 dengan giardine atau pcDNA3.1(+)-alpha-7,3 kumpulan giardine atau kumpulan kawalan positif GEV (Rajah 2d).Dalam kawalan negatif dan kumpulan pcDNA 3.1 yang dirawat plasmid, isyarat protein NLRP3 tidak dikesan, manakala titik isyarat pendarfluor sebagai tindak balas kepada pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 telah dikesan..giardine ditemui dalam sitoplasma atau semasa rangsangan HEV (Rajah 2e).Data ini selanjutnya menunjukkan bahawa G. duodenalis giardin alpha-2 dan giardin alpha-7.3 mengaktifkan inflammasom NLRP3 dalam makrofaj peritoneal primer tikus.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin mengaktifkan inflammasom NLRP3 dalam makrofaj peritoneal tikus.Memindahkan plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ke dalam makrofaj dan sel peritoneal murine primer, atau menuai supernatan dalam masa 24 jam untuk analisis ekspresi, oligomerisasi , rembesan.dan penyetempatan protein keradangan utama.Kumpulan PBS sahaja (C) dan kumpulan rawatan tunggal pcDNA3.1(+) digunakan sebagai kawalan negatif, dan kumpulan rawatan GEV digunakan sebagai kumpulan positif.Protein keradangan utama NLRP3, termasuk NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, dan p20 caspase-1, telah dikesan oleh Western blotting.b Tahap rembesan IL-1β dalam supernatan ditentukan menggunakan ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA).Perbezaan antara kumpulan kawalan dan eksperimen telah dianalisis dengan analisis varians sehala (ANOVA) menggunakan perisian SPSS versi 22.0.Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara antara kumpulan **P<0.01 dan ***P<0.001.c Tahap oligomerisasi ASC dalam pelet ditentukan oleh analisis silang silang DSS, manakala tahap ASC dalam lisat sel digunakan sebagai kawalan pemuatan.d Visualisasi penyetempatan ISC menggunakan imunofluoresensi.e Immunofluorescence digunakan untuk menggambarkan penyetempatan NLRP3.ASC, protein seperti bintik apoptosis;IL, interleukin;NLRP3, reseptor seperti oligomerisasi pengikat nukleotida 3;ns, tidak ketara (P > 0.05)
Kedua-dua G. duodenalis dan GEV yang dirembeskannya mengaktifkan inflammasom NLRP3 dan mengawal tindak balas keradangan perumah secara in vitro.Oleh itu, peranan inflammasom NLRP3 dalam patogenik G. duodenalis masih tidak jelas.Untuk menyiasat isu ini, kami mereka bentuk eksperimen antara tikus yang dijangkiti sista G. duodenalis dan tikus yang dijangkiti sista G. duodenalis + rawatan perencat MCC950 dan membandingkan ekspresi keradangan NLRP3 apabila dijangkiti sista G. duodenalis.Skim terperinci eksperimen ditunjukkan dalam Rajah 3a.Perubahan dalam berat badan tikus dalam kumpulan rawatan yang berbeza telah dipantau selama 7 hari selepas jangkitan dengan sista, dan keputusan ditunjukkan dalam Rajah 3b.Berbanding dengan kumpulan yang dirawat dengan PBS tulen, keputusan menunjukkan bahawa (i) berat badan tikus yang dijangkiti sista G. duodenalis menurun dari hari ke-3 hingga hari ke-7 selepas jangkitan;(ii) rawatan dengan perencat MCC950 tidak mempunyai kesan yang ketara ke atas berat badan tikus..Berbanding dengan kumpulan jangkitan tunggal, BW kumpulan jangkitan duodenal yang dirawat dengan MCC950 menurun kepada tahap yang berbeza-beza (Hari 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Hari 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; Hari 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Hari 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175;Data ini menunjukkan bahawa inflammasom NLRP3 melindungi tikus daripada penurunan berat badan yang ketara pada peringkat awal (2-4 hari) jangkitan duodenum.Kami kemudiannya bertujuan untuk mengesan G. duodenalis trophozoites dalam cecair lavage duodenal dan hasilnya ditunjukkan dalam Rajah 3c.Berbanding dengan kumpulan jangkitan sista G. duodenalis, bilangan trofozoit dalam duodenum meningkat dengan ketara selepas menyekat inflammasom NLRP3 (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Tisu duodenal yang diwarnai dengan HE menunjukkan, berbanding kawalan negatif yang dirawat dengan PBS dan MCC950 sahaja: ​​(i) jangkitan sista G. duodenalis mengakibatkan kerosakan pada vili duodenal (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) dan atrofi crypt (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duodenum daripada tikus yang dijangkiti sista G. duodenalis dan dirawat dengan perencat MCC950.villi duodenal telah rosak dan mati (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) dengan atrofi dan cawangan crypt (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Rajah 3d- f).Keputusan ini menunjukkan bahawa inflammasom NLRP3 memainkan peranan dalam mengurangkan patogenik G. duodenalis.
Peranan inflammasom NLRP3 dalam jangkitan Giardia duodenum.Tikus telah digavage (iv) dengan sista duodenokokal dan kemudian dirawat dengan atau tanpa MCC950 (ip).Kumpulan rawatan tunggal dengan PBS atau MCC950 digunakan sebagai kawalan.Kumpulan eksperimen dan rejimen rawatan.b Berat badan tikus dalam setiap kumpulan rawatan dipantau selama 7 hari.Perbezaan antara kumpulan jangkitan G. duodenalis dan kumpulan rawatan jangkitan G. duodenalis + MCC950 dianalisis dengan ujian-t menggunakan perisian SPSS versi 22.0.Asterisk menunjukkan perbezaan ketara pada *P<0.05, **P<0.01, atau ***P<0.001.c Beban parasit ditentukan dengan mengira bilangan trofozoit dalam cecair lavage duodenal.Perbezaan antara kumpulan jangkitan G. duodenalis dan kumpulan rawatan jangkitan G. duodenalis + MCC950 dianalisis dengan ujian-t menggunakan perisian SPSS versi 22.0.Asterisk menunjukkan perbezaan ketara pada *P <0.05.d Hematoxylin dan eosin (H&E) hasil pewarnaan histopatologi duodenum.Anak panah merah menunjukkan kerosakan pada villi, anak panah hijau menunjukkan kerosakan pada crypts.Bar skala: 100 µm.e, f Analisis statistik ketinggian vilus duodenum dan ketinggian crypt tikus.Asterisk menunjukkan perbezaan ketara pada *P<0.05 dan **P<0.01.Keputusan diambil daripada 7 eksperimen biologi bebas.BW, berat badan;ig, laluan penghantaran intragastrik;ip, laluan penghantaran intraperitoneal;ns, tidak ketara (P > 0.05);PBS, garam terbuffer fosfat;WT, jenis liar
Rembesan IL-1β adalah ciri pengaktifan keradangan.Untuk menentukan sama ada G. duodenalis alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine mengaktifkan inflammasom hos NLRP3 dalam vivo, kami menggunakan tikus WT yang tidak dirawat (kumpulan palsu) dan tikus yang disekat inflammasom NLRP3 (kumpulan rawatan terhalang MCC950).Skim terperinci eksperimen ditunjukkan dalam Rajah 4a.Kumpulan eksperimen terdiri daripada tikus yang dirawat dengan PBS, rawatan sista G. duodenalis secara gavage, suntikan intramuskular pcDNA3.1, dan suntikan intramuskular pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Pada hari ke-7 selepas pentadbiran intramuskular plasmid rekombinan, serum dikumpulkan dan tahap IL-1β dalam setiap kumpulan ditentukan.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4b, dalam kumpulan MOCK: (i) berbanding kumpulan PBS, rawatan pcDNA3.1 tidak mempunyai kesan yang ketara ke atas rembesan IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), namun, Rembesan IL-β meningkat dengan ketara dalam kumpulan sista G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine dan pcDNA3.1- Suntikan intramuskular alpha-7.3 giardine meningkat dengan ketara paras IL-1β serum (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine menyebabkan rembesan IL -1β yang tinggi dalam kumpulan suntikan intramuskular giardine pcDNA3.1-alpha-2 (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Berbanding dengan setiap kumpulan dalam kumpulan rawatan MCC950 dan kumpulan MOCK: (i) Tahap rembesan IL-1β dalam kumpulan kawalan PBS dan kumpulan kawalan pcDNA3.1 menurun ke tahap tertentu selepas menyekat perencat MCC950, tetapi perbezaannya tidak ketara (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) selepas menyekat MCC950., rembesan IL-1β dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan yang dijangkiti sista G. duodenalis, kumpulan giardine pcDNA3.1-alpha-2, dan kumpulan giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; ) = 3.540, P = 0.0164).Keputusan ini menunjukkan bahawa alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine memediasi pengaktifan inflammasom NLRP3 dalam vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines mengaktifkan inflammasom hos NLRP3 dalam vivo.Tikus telah diimunisasi (IM) dengan plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine dan kemudian dirawat dengan MCC950 (ip; kumpulan MCC950) atau tidak (kumpulan dummy ).Kumpulan rawatan plasmid PBS atau pcDNA3.1(+) digunakan sebagai kawalan negatif, kumpulan rawatan sista G. duodenalis digunakan sebagai kawalan positif.Kumpulan eksperimen dan rejimen rawatan.b Tahap serum IL-1β pada tikus diukur pada hari ke-7 oleh ujian ELISA.Perbezaan antara kumpulan dalam kumpulan MOCK dianalisis menggunakan ANOVA sehala, dan perbezaan antara kumpulan MOCK dan kumpulan MCC950 dianalisis menggunakan ujian-t perisian SPSS versi 22.0.Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara antara kumpulan rawatan dalam kumpulan MOCK, * P<0.05 dan *** P<0.001;tanda dolar ($) menunjukkan perbezaan yang ketara antara setiap kumpulan dalam kumpulan MOCK dan kumpulan MCC950 pada P<0.05.Keputusan tujuh eksperimen biologi bebas.i, suntikan intramuskular, ns, tidak ketara (P > 0.05)
Untuk menyiasat kesan pengaktifan alpha-2 dan alpha-7.3 giardine-mediated of the NLRP3 host inflammasome pada G. duodenalis infectivity, kami menggunakan WT C57BL/6 tikus dan menyuntik alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine.plasmid disuntik secara intramuskular, selepas 3 hari melalui tiub gastrik sista G. duodenalis, selepas itu tikus diperhatikan selama 7 hari.Skim terperinci eksperimen ditunjukkan dalam Rajah 5a.Berat badan setiap tetikus diukur setiap hari, sampel tisu duodenal segar dikumpulkan pada hari ke-7 selepas pentadbiran melalui tiub gastrik, bilangan trofozoit diukur, dan perubahan histopatologi diperhatikan.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5b, dengan peningkatan masa makan, BW tikus dalam setiap kumpulan secara beransur-ansur meningkat.MT tikus mula berkurangan pada hari ke-3 selepas pentadbiran intragastrik sista G. duodenalis, dan kemudian secara beransur-ansur meningkat.Pengaktifan inflammasom NLRP3 yang disebabkan oleh suntikan intramuskular alpha-2 giardine dan alpha7.3 giardine dengan ketara melemahkan penurunan berat badan pada tikus (Hari 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Hari 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Hari 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Hari 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Hari 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 Hari 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Hari 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Hari 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Hari 5: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Hari 6: pcDNA3 . alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Hari 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Hari 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Hari 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Beban parasit telah dinilai dalam duodenum (Rajah 5c).Berbanding dengan kawalan positif yang tidak dirawat dan kumpulan yang disuntik dengan vektor pcDNA3.1 kosong, bilangan trophozoit G. duodenalis berkurangan dengan ketara dalam kumpulan yang disuntik dengan α-2 giardine dan α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Di samping itu, giardine alfa-7.3 lebih melindungi tikus daripada giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Keputusan pewarnaan HE ditunjukkan dalam rajah.5d–f.Tikus yang disuntik dengan alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine mempunyai lesi tisu duodenal yang lebih sedikit, yang ditunjukkan oleh kerosakan vilus, berbanding dengan tikus yang disuntik dengan G. duodenalis dan tikus yang disuntik dengan G. duodenalis dalam kombinasi dengan vektor pcDNA3 kosong .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 atau P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 atau P = 0.0055) dan mengurangkan atrofi crypt (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 atau P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 atau P = 0.0191).Keputusan ini menunjukkan bahawa alpha-2 giardine dan alpha-7,3 giardine mengurangkan infektiviti G. duodenalis dengan mengaktifkan inflammasom NLRP3 dalam vivo.
Peranan pcDNA3.1(+)-giardins dalam jangkitan G. duodenalis.Tikus telah diimunisasi (IM) dengan plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine dan kemudian dicabar dengan sista G. duodenalis (ig).Kumpulan PBS dan kumpulan rawatan pcDNA3.1(+) + duodenal cyst digunakan sebagai kumpulan kawalan negatif, dan kumpulan rawatan sista duodenal digunakan sebagai kumpulan kawalan positif.Kumpulan eksperimen dan rejimen rawatan.b MT tikus dalam setiap pelbagai kumpulan rawatan dipantau selama 7 hari selepas cabaran.Asterisk menunjukkan perbezaan ketara antara kumpulan dalam kumpulan G. duodenalis dan kumpulan giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2, *P <0.05, **P <0.01, dan ***P <0.001;tanda dolar ($) menunjukkan perbezaan yang ketara antara setiap kumpulan G. duodenalis dan kumpulan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 dan $$$P<0.001.c Beban parasit ditentukan dengan mengira bilangan trofozoit dalam 1 ml lavage duodenal dari duodenum (3 cm panjang) dan dinyatakan sebagai bilangan parasit per cm duodenum.Perbezaan antara kumpulan jangkitan G. duodenalis, kumpulan giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan kumpulan giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 telah dianalisis dengan ANOVA sehala menggunakan perisian SPSS versi 22.0.Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara pada **P<0.01 dan ***P<0.001.d Perubahan histopatologi dalam duodenum.Anak panah merah menunjukkan kerosakan pada villi, anak panah hijau menunjukkan kerosakan pada crypts.Bar skala: 100 µm.e, f Analisis statistik ketinggian vilus duodenal tikus (e) dan ketinggian crypt (f).Perbezaan antara kumpulan dalam Rajah 1d telah dianalisis dengan ANOVA sehala menggunakan perisian SPSS versi 22.0.Asterisk menunjukkan perbezaan ketara pada *P<0.05 dan **P<0.01.Keputusan tujuh eksperimen biologi bebas.ns, tidak ketara (P > 0.05)
Giardia duodenum adalah parasit usus yang terkenal pada manusia dan mamalia lain yang menyebabkan giardiasis.Pada tahun 2004, ia telah dimasukkan dalam Inisiatif Penyakit Terabai WHO kerana prevalensnya yang tinggi selama 6 tahun, terutamanya dalam komuniti yang mempunyai status sosioekonomi rendah [32].Sistem imun semula jadi memainkan peranan penting dalam tindak balas imun terhadap jangkitan G. duodenalis.Makrofaj tikus telah dilaporkan menelan dan membunuh G. duodenalis dengan melepaskan perangkap ekstraselular [33].Kajian terdahulu kami telah menunjukkan bahawa G. duodenalis, parasit ekstraselular bukan invasif, mengaktifkan p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, dan laluan isyarat keradangan NLRP3 dalam makrofaj tetikus untuk mengawal tindak balas keradangan perumah, dan GEV yang dikeluarkan boleh meningkatkan proses ini.13], 24].Walau bagaimanapun, PAMP tepat yang terlibat dalam keradangan terkawal inflammasom NLRP3 dalam GEV dan peranan inflammasom NLRP3 dalam giardiasis masih belum dijelaskan.Untuk menjelaskan kedua-dua persoalan ini, kami menjalankan kajian ini.
Inflammasom NLRP3 terletak di dalam sitoplasma sel imun dan boleh diaktifkan oleh pelbagai zarah seperti kristal asid urik, toksin, bakteria, virus dan parasit.Dalam kajian bakteria, toksin telah dikenal pasti sebagai PAMP utama yang mengaktifkan sensor keradangan, yang membawa kepada keradangan dan kematian sel [34].Beberapa toksin yang pelbagai struktur, seperti hemolysin daripada Staphylococcus aureus [35] dan Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) daripada enterotoxin (NHE) [37], mendorong pengaktifan keradangan NLRP3.Kajian virus telah menunjukkan bahawa protein virulensi seperti protein sampul (E) SARS-COV-2 [38] dan protein NS5 virus Zika [39] adalah PAMP penting yang diiktiraf oleh reseptor NLRP3.Dalam kajian parasit, banyak parasit telah dilaporkan dikaitkan dengan pengaktifan inflammasom perumah, seperti Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], dan Leishmania [42].Protein granul padat GRA35, GRA42, dan GRA43, yang dikaitkan dengan virulensi Toxoplasma gondii, diperlukan untuk induksi pyroptosis dalam makrofaj tikus Lewis [43].Di samping itu, beberapa kajian Leishmania telah memberi tumpuan kepada molekul individu yang terlibat dalam inflammasom NLRP3, seperti lipophosphoglycan membran parasit [44] atau metalloprotease zink [45].Di antara keluarga gen alpha-giardin seperti annexin, alpha-1 giardin telah ditunjukkan sebagai calon vaksin yang berpotensi memberikan perlindungan terhadap G. duodenalis dalam model tetikus [18].Dalam kajian kami, kami memilih faktor virulensi G. duodenalis alpha-2 dan alpha-7,3 giardines, yang unik kepada giardia tetapi agak kurang dilaporkan.Kedua-dua gen sasaran ini telah diklon ke dalam vektor sistem ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+) untuk analisis pengaktifan keradangan.
Dalam model tetikus kami, serpihan caspase yang dibelah berfungsi sebagai penanda pengaktifan keradangan.Selepas rangsangan, NLRP3 berinteraksi dengan ASC, merekrut procaspases, dan menghasilkan caspases aktif yang membelah pro-IL-1β dan pro-IL-18 menjadi IL-1β dan IL-18 matang, masing-masing -18.Caspases keradangan (caspases-1, -4, -5 dan -11) ialah keluarga protease sistein yang dipelihara yang penting untuk pertahanan semula jadi dan terlibat dalam keradangan dan kematian sel yang diprogramkan [46].Caspase-1 diaktifkan oleh inflammasom kanonik [47], manakala caspases-4, -5, dan -11 dibelah semasa pembentukan inflammasom atipikal [48].Dalam kajian ini, kami menggunakan makrofaj peritoneal tikus sebagai model dan menyiasat p20 caspase-1 membelah caspase-1 sebagai penanda pengaktifan keradangan NLRP3 hos dalam kajian jangkitan G. duodenalis.Keputusan menunjukkan bahawa banyak alpha-giardin bertanggungjawab untuk pengaktifan tipikal keradangan, yang konsisten dengan penemuan molekul virulensi utama yang terlibat dalam bakteria dan virus.Walau bagaimanapun, kajian kami hanyalah skrin awal dan terdapat molekul lain yang boleh mengaktifkan inflammasom bukan klasik, kerana kajian terdahulu kami mendapati kedua-dua inflammasom klasik dan bukan klasik dalam jangkitan G. duodenalis [13].Untuk menentukan lebih lanjut sama ada p20 caspase-1 yang dihasilkan dikaitkan dengan inflammasom NLRP3, kami mengalihkan alpha-2 dan alpha-7.3 giardins ke dalam makrofaj peritoneal tetikus untuk menentukan tahap ekspresi protein molekul utama dan tahap oligomerisasi ASC, mengesahkan bahawa kedua-dua α-giardins diaktifkan radang NLRP3.Keputusan kami sedikit berbeza daripada Manko-Prykhoda et al., yang melaporkan bahawa rangsangan sel Caco-2 dengan strain G. muris atau E. coli EPEC sahaja boleh meningkatkan intensiti pendarfluor NLRP3, ASC, dan caspase-1, walaupun tidak ketara, manakala bagaimana kostimulasi G. muris dan E. coli meningkatkan tahap tiga protein [49].Percanggahan ini mungkin disebabkan oleh perbezaan dalam pemilihan spesies Giardia, garisan sel dan sel primer.Kami juga melakukan ujian in vivo menggunakan MCC950 pada tikus WT C57BL/6 betina berusia 5 minggu, yang lebih mudah terdedah kepada G. duodenalis.MCC950 ialah perencat NLRP3 molekul kecil yang kuat dan terpilih yang menyekat pengaktifan NLRP3 kanonik dan bukan kanonik pada kepekatan nanomolar.MCC950 menghalang pengaktifan NLRP3 tetapi tidak menjejaskan pengaktifan laluan keradangan AIM2, NLRC4, dan NLRP1 atau laluan isyarat TLR [27].MCC950 menyekat pengaktifan NLRP3 tetapi tidak menghalang permulaan NLRP3, efluks K+, kemasukan Ca2+ atau interaksi antara NLRP3 dan ASC;sebaliknya, ia menghalang pengaktifan inflammasom NLRP3 dengan menyekat oligomerisasi ASC [27].Oleh itu, kami menggunakan MCC950 dalam kajian in vivo untuk menentukan peranan inflammasom NLRP3 selepas suntikan giardine.Caspase-1 p10 yang diaktifkan memecah sitokin pro-radang pro-IL-1β dan pro-IL-18 menjadi IL-1β dan IL-18 matang [50].Dalam kajian ini, paras serum IL-1β dalam tikus yang dirawat giardine dengan atau tanpa MCC950 digunakan sebagai penunjuk sama ada inflammasom NLRP3 telah diaktifkan.Seperti yang dijangkakan, rawatan MCC950 telah mengurangkan tahap IL-1β serum dengan ketara.Data-data ini jelas menunjukkan bahawa G. duodenalis giardin alfa-2 dan giardin alfa-7.3 dapat mengaktifkan inflammasom tetikus NLRP3.
Data penting yang terkumpul sepanjang dekad yang lalu telah menunjukkan bahawa IL-17A ialah pengawal selia utama imuniti terhadap G. muris, mendorong isyarat IL-17RA, menghasilkan peptida antimikrobial, dan mengawal pengaktifan pelengkap [51].Walau bagaimanapun, jangkitan Giardia lebih kerap berlaku pada orang dewasa muda, dan telah dilaporkan bahawa jangkitan Giardia pada tikus muda tidak mengaktifkan tindak balas IL-17A untuk memberikan kesan perlindungannya [52], mendorong penyelidik untuk mencari Giardia imunomodulator lain.mekanisme jangkitan helminth.Penulis kajian baru-baru ini melaporkan bahawa G. muris boleh mengaktifkan inflammasom NLRP3 oleh E. coli EPEC, yang menggalakkan pengeluaran peptida antimikrob dan mengurangkan kapasiti lampirannya dan bilangan trofozoit dalam saluran usus, dengan itu mengurangkan keterukan kolon. penyakit yang disebabkan oleh bacilli [49].Inflammasom NLRP3 terlibat dalam perkembangan pelbagai penyakit.Kajian telah menunjukkan bahawa Pseudomonas aeruginosa mencetuskan autophagy dalam makrofaj untuk mengelakkan kematian sel, dan proses ini bergantung kepada pengaktifan inflammasom NLRP3 [53].Untuk N. caninum, pengaktifan pengantara spesies oksigen reaktif bagi inflammasom NLRP3 mengehadkan replikasinya dalam perumah, menjadikannya sasaran terapeutik yang berpotensi [9].Paracoccidioides brasiliensis telah didapati mendorong pengaktifan inflammasom NLRP3 dalam sel dendritik yang berasal dari sumsum tulang tikus, mengakibatkan pembebasan sitokin radang IL-1β, yang memainkan peranan penting dalam pertahanan tuan rumah [10].Beberapa spesies Leishmania, termasuk L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, dan L. infantum chagasi, mengaktifkan NLRP3 dan caspase-1 yang bergantung kepada ASC dalam makrofaj, serta jangkitan Leishmania.Replikasi parasit dipertingkatkan pada tikus yang kekurangan gen NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.Jangkitan Leishmania telah dilaporkan menyebabkan pengaktifan inflammasom NLRP3 dalam makrofaj, yang mengehadkan replikasi parasit intraselular.Oleh itu, Leishmania mungkin menghalang pengaktifan NLRP3 sebagai strategi pengelakan.Dalam kajian in vivo, inflammasom NLRP3 menyumbang kepada penghapusan Leishmania, tetapi tidak menjejaskan tisu [54].Sebaliknya, dalam kajian helminthiasis, pengaktifan inflammasom NLRP3 menindas imuniti pelindung hos terhadap helminthiasis gastrousus [12].Shigella adalah salah satu bakteria utama yang menyebabkan cirit-birit di seluruh dunia.Bakteria ini boleh mendorong pengeluaran IL-1β melalui efluks K+ pengantara reseptor P2X7, spesies oksigen reaktif, pengasidan lisosom, dan kerosakan mitokondria.Inflammasom NLRP3 secara negatif mengawal fagositosis dan aktiviti bakterisida makrofaj terhadap Shigella [55].Kajian Plasmodium telah menunjukkan bahawa tikus kekurangan AIM2, NLRP3 atau caspase-1 yang dijangkiti Plasmodium menghasilkan interferon jenis 1 yang tinggi dan lebih tahan terhadap jangkitan Plasmodium [56].Walau bagaimanapun, peranan alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine dalam mendorong pengaktifan patogenik keradangan NLRP3 pada tikus tidak jelas.
Dalam kajian ini, perencatan inflammasom NLRP3 oleh MCC950 mengurangkan BW dan meningkatkan bilangan trofozoit dalam cecair lavage usus pada tikus, mengakibatkan perubahan patologi yang lebih teruk dalam tisu duodenal.Alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine mengaktifkan inflammasom NLRP3 tikus hos, meningkatkan berat badan tetikus, mengurangkan bilangan trofozoit dalam cecair lavage usus, dan mengurangkan lesi duodenal patologi.Keputusan ini menunjukkan bahawa G. duodenalis boleh mengaktifkan inflammasom perumah NLRP3 melalui alpha-2 giardine dan alpha-7,3 giardine, mengurangkan patogenik G. duodenalis pada tikus.
Secara kolektif, keputusan kami menunjukkan bahawa alpha-2 dan alpha-7.3 giardine mendorong pengaktifan inflammasom hos NLRP3 dan mengurangkan kejangkitan G. duodenalis pada tikus.Oleh itu, molekul ini adalah sasaran yang menjanjikan untuk pencegahan giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: gambaran keseluruhan.Baru-baru ini telah mendedahkan bahawa Pat Inflamm alah kepada dadah.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: kajian farmakoterapi.Pendapat Pakar ahli farmasi.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, rintangan dadah dan penemuan sasaran baru.Menjangkiti sasaran dadah Disorder.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, dll. NLRP3 penyakit radang dan radang.Oksida Med Sel Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Peranan inflammasom dalam keradangan usus dan kanser.Gastroenterologi.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical dan pengaktifan inflammasom NLRP3 atipikal di persimpangan toleransi imun dan keradangan usus.pra-imun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Pengaktifan inflammasom NLRP3 yang dimediasi ROS terlibat sebagai tindak balas kepada jangkitan N. caninum.Vektor parasit.2020;13:449.