Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Vektor gen untuk rawatan fibrosis kistik pulmonari mesti disasarkan kepada saluran udara konduktif, kerana transduksi paru-paru periferi tidak mempunyai kesan terapeutik.Kecekapan transduksi virus secara langsung berkaitan dengan masa kediaman pembawa.Walau bagaimanapun, cecair penghantaran seperti pembawa gen secara semula jadi meresap ke dalam alveoli semasa penyedutan, dan zarah terapeutik dalam sebarang bentuk dengan cepat dikeluarkan oleh pengangkutan mukosiliari.Memanjangkan masa tinggal pembawa gen dalam saluran pernafasan adalah penting tetapi sukar untuk dicapai.Zarah magnet konjugasi pembawa yang boleh diarahkan ke permukaan saluran pernafasan boleh meningkatkan penyasaran serantau.Disebabkan masalah dengan pengimejan in vivo, tingkah laku zarah magnet yang kecil pada permukaan saluran udara dengan kehadiran medan magnet yang digunakan kurang difahami.Matlamat kajian ini adalah untuk menggunakan pengimejan synchrotron untuk memvisualisasikan dalam vivo pergerakan satu siri zarah magnet dalam trakea tikus yang dibius untuk mengkaji dinamik dan corak tingkah laku zarah tunggal dan pukal dalam vivo.Kami kemudian juga menilai sama ada penghantaran zarah magnet lentiviral dengan kehadiran medan magnet akan meningkatkan kecekapan transduksi dalam trakea tikus.Pengimejan sinar-X Synchrotron menunjukkan kelakuan zarah magnet dalam medan magnet pegun dan bergerak secara in vitro dan in vivo.Zarah tidak boleh diseret dengan mudah merentasi permukaan saluran udara hidup menggunakan magnet, tetapi semasa pengangkutan, deposit tertumpu di medan pandangan, di mana medan magnet paling kuat.Kecekapan transduksi juga meningkat enam kali ganda apabila zarah magnet lentiviral dihantar dengan kehadiran medan magnet.Diambil bersama, keputusan ini mencadangkan bahawa zarah magnet lentiviral dan medan magnet mungkin merupakan pendekatan yang berharga untuk meningkatkan penyasaran vektor gen dan tahap transduksi dalam saluran udara konduktif dalam vivo.
Fibrosis kistik (CF) disebabkan oleh variasi dalam satu gen yang dipanggil pengatur konduktans transmembran CF (CFTR).Protein CFTR ialah saluran ion yang terdapat dalam banyak sel epitelium di seluruh badan, termasuk saluran pernafasan, tapak utama dalam patogenesis fibrosis kistik.Kecacatan pada CFTR membawa kepada pengangkutan air yang tidak normal, dehidrasi permukaan saluran udara, dan penurunan kedalaman lapisan cecair permukaan saluran udara (ASL).Ia juga menjejaskan keupayaan sistem pengangkutan mukosiliari (MCT) untuk membersihkan saluran pernafasan daripada zarah dan patogen yang disedut.Matlamat kami adalah untuk membangunkan terapi gen lentiviral (LV) untuk menyampaikan salinan gen CFTR yang betul dan meningkatkan kesihatan ASL, MCT dan paru-paru, serta untuk terus membangunkan teknologi baharu yang boleh mengukur parameter ini dalam vivo1.
Vektor LV adalah salah satu calon utama untuk terapi gen cystic fibrosis, terutamanya kerana mereka boleh menyepadukan gen terapeutik secara kekal ke dalam sel basal saluran udara (sel stem saluran pernafasan).Ini penting kerana ia boleh memulihkan penghidratan normal dan pelepasan lendir dengan membezakan sel-sel permukaan saluran pernafasan yang diperbetulkan gen berfungsi yang dikaitkan dengan cystic fibrosis, menghasilkan manfaat sepanjang hayat.Vektor LV mesti diarahkan ke saluran udara konduktif, kerana di sinilah penglibatan paru-paru dalam CF bermula.Penghantaran vektor lebih dalam ke dalam paru-paru boleh mengakibatkan transduksi alveolar, tetapi ini tidak mempunyai kesan terapeutik dalam fibrosis kistik.Walau bagaimanapun, cecair seperti pembawa gen secara semula jadi berhijrah ke dalam alveoli apabila disedut selepas bersalin3,4 dan zarah terapeutik dengan cepat dikeluarkan ke dalam rongga mulut oleh MCT.Kecekapan transduksi LV secara langsung berkaitan dengan tempoh masa vektor kekal dekat dengan sel sasaran untuk membolehkan pengambilan selular - "masa tinggal" 5 yang mudah dipendekkan oleh aliran udara serantau biasa serta pengambilan lendir dan zarah MCT yang diselaraskan.Untuk fibrosis kistik, keupayaan untuk memanjangkan masa tinggal LV di saluran pernafasan adalah penting untuk mencapai tahap transduksi yang tinggi di kawasan ini, tetapi setakat ini adalah mencabar.
Untuk mengatasi halangan ini, kami mencadangkan zarah magnetik LV (MP) boleh membantu dalam dua cara yang saling melengkapi.Pertama, mereka boleh dipandu oleh magnet ke permukaan saluran udara untuk meningkatkan penargetan dan membantu zarah pembawa gen berada di kawasan saluran udara yang betul;dan ASL) bergerak ke lapisan sel 6. Ahli Parlimen digunakan secara meluas sebagai kenderaan penghantaran dadah yang disasarkan apabila mereka mengikat antibodi, ubat kemoterapi atau molekul kecil lain yang melekat pada membran sel atau mengikat pada reseptor permukaan sel masing-masing dan terkumpul di tapak tumor dalam kehadiran elektrik statik.Medan magnet untuk terapi kanser 7. Kaedah "hipertermik" lain bertujuan untuk membunuh sel tumor dengan memanaskan MP apabila terdedah kepada medan magnet berayun.Prinsip pemindahan magnet, di mana medan magnet digunakan sebagai agen pemindahan untuk meningkatkan pemindahan DNA ke dalam sel, biasanya digunakan secara in vitro menggunakan pelbagai vektor gen bukan virus dan virus untuk saluran sel yang sukar transduksi. ..Kecekapan transfeksi magnet LV dengan penghantaran MP LV secara in vitro ke dalam barisan sel epitelium bronkial manusia dengan kehadiran medan magnet statik telah ditubuhkan, meningkatkan kecekapan transduksi sebanyak 186 kali berbanding dengan vektor LV sahaja.LV MT juga telah digunakan pada model in vitro fibrosis kistik, di mana pemindahan magnetik meningkatkan transduksi LV dalam kultur antara muka cecair udara dengan faktor 20 dengan kehadiran sputum fibrosis kistik10.Walau bagaimanapun, magnetotransfection organ in vivo telah mendapat sedikit perhatian dan hanya dinilai dalam beberapa kajian haiwan11,12,13,14,15, terutamanya dalam paru-paru16,17.Walau bagaimanapun, kemungkinan pemindahan magnet dalam terapi paru-paru dalam fibrosis kistik adalah jelas.Tan et al.(2020) menyatakan bahawa "kajian pengesahan mengenai penghantaran pulmonari nanopartikel magnetik yang berkesan akan membuka jalan untuk strategi penyedutan CFTR masa depan untuk meningkatkan hasil klinikal pada pesakit dengan cystic fibrosis"6.
Tingkah laku zarah magnet kecil pada permukaan saluran pernafasan dengan kehadiran medan magnet yang digunakan adalah sukar untuk divisualisasikan dan dikaji, dan oleh itu ia kurang difahami.Dalam kajian lain, kami telah membangunkan kaedah Pengimejan X-Ray Kontras Fasa Penyebaran Synchrotron (PB-PCXI) untuk pengimejan tidak invasif dan pengiraan perubahan minit dalam vivo dalam kedalaman ASL18 dan tingkah laku MCT19,20 untuk mengukur secara langsung penghidratan permukaan saluran gas dan digunakan sebagai penunjuk keberkesanan rawatan awal.Selain itu, kaedah pemarkahan MCT kami menggunakan zarah diameter 10–35 µm yang terdiri daripada alumina atau kaca indeks biasan tinggi sebagai penanda MCT yang boleh dilihat dengan PB-PCXI21.Kedua-dua kaedah ini sesuai untuk pengimejan pelbagai jenis zarah, termasuk Ahli Parlimen.
Oleh kerana resolusi spatial dan temporal yang tinggi, ujian ASL dan MCT berasaskan PB-PCXI kami sangat sesuai untuk mengkaji dinamik dan corak tingkah laku zarah tunggal dan pukal dalam vivo untuk membantu kami memahami dan mengoptimumkan kaedah penghantaran gen MP.Pendekatan yang kami gunakan di sini adalah berdasarkan kajian kami menggunakan garis pancaran SPring-8 BL20B2, di mana kami memvisualisasikan pergerakan cecair berikutan penghantaran dos vektor tiruan ke dalam saluran pernafasan hidung dan paru-paru tikus untuk membantu menjelaskan corak ekspresi gen heterogen kami yang diperhatikan. dalam gen kita.kajian haiwan dengan dos pembawa 3.4 .
Matlamat kajian ini adalah untuk menggunakan synchrotron PB-PCXI untuk memvisualisasikan pergerakan in vivo satu siri Ahli Parlimen dalam trakea tikus hidup.Kajian pengimejan PB-PCXI ini direka untuk menguji siri MP, kekuatan medan magnet dan lokasi untuk menentukan kesannya terhadap pergerakan MP.Kami mengandaikan bahawa medan magnet luaran akan membantu MF yang dihantar kekal atau bergerak ke kawasan sasaran.Kajian-kajian ini juga membolehkan kami menentukan konfigurasi magnet yang memaksimumkan jumlah zarah yang tersisa di trakea selepas pemendapan.Dalam siri kedua kajian, kami berhasrat untuk menggunakan konfigurasi optimum ini untuk menunjukkan corak transduksi yang terhasil daripada penghantaran in vivo LV-MP ke saluran udara tikus, dengan andaian bahawa penghantaran LV-MP dalam konteks penyasaran saluran pernafasan akan menghasilkan dalam peningkatan kecekapan transduksi LV..
Semua kajian haiwan dijalankan mengikut protokol yang diluluskan oleh Universiti Adelaide (M-2019-060 dan M-2020-022) dan Jawatankuasa Etika Haiwan Synchrotron SPring-8.Eksperimen telah dijalankan mengikut cadangan ARRIVE.
Semua imej x-ray telah diambil pada beamline BL20XU pada synchrotron SPring-8 di Jepun menggunakan persediaan yang serupa dengan yang diterangkan sebelum ini21,22.Secara ringkas, kotak eksperimen terletak 245 m dari gelang storan synchrotron.Jarak sampel ke pengesan 0.6 m digunakan untuk kajian pengimejan zarah dan 0.3 m untuk kajian pengimejan in vivo untuk mencipta kesan kontras fasa.Rasuk monokromatik dengan tenaga 25 keV telah digunakan.Imej-imej itu diperoleh menggunakan transduser sinar-X resolusi tinggi (SPring-8 BM3) yang digabungkan dengan pengesan sCMOS.Transduser menukar sinar-X kepada cahaya yang boleh dilihat menggunakan scintillator tebal 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), yang kemudiannya diarahkan ke sensor sCMOS menggunakan objektif mikroskop ×10 (NA 0.3).Pengesan sCMOS ialah Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepun) dengan saiz tatasusunan 2048 × 2048 piksel dan saiz piksel mentah 6.5 × 6.5 µm.Tetapan ini memberikan saiz piksel isotropik berkesan 0.51 µm dan medan pandangan kira-kira 1.1 mm × 1.1 mm.Tempoh pendedahan 100 ms dipilih untuk memaksimumkan nisbah isyarat-ke-bunyi zarah magnet di dalam dan di luar saluran udara sambil meminimumkan artifak gerakan yang disebabkan oleh pernafasan.Untuk kajian in vivo, pengatup sinar-X yang pantas diletakkan di laluan sinar-X untuk mengehadkan dos sinaran dengan menyekat pancaran sinar-X antara dedahan.
Media LV tidak digunakan dalam mana-mana kajian pengimejan SPring-8 PB-PCXI kerana ruang pengimejan BL20XU tidak diperakui Tahap Biokeselamatan 2.Sebaliknya, kami memilih pelbagai Ahli Parlimen yang dicirikan dengan baik daripada dua vendor komersil yang meliputi pelbagai saiz, bahan, kepekatan besi dan aplikasi , — mula-mula untuk memahami cara medan magnet mempengaruhi pergerakan Ahli Parlimen dalam kapilari kaca, dan kemudian dalam saluran udara hidup.permukaan.Saiz MP berbeza dari 0.25 hingga 18 µm dan diperbuat daripada pelbagai bahan (lihat Jadual 1), tetapi komposisi setiap sampel, termasuk saiz zarah magnet dalam MP, tidak diketahui.Berdasarkan kajian MCT kami yang luas 19, 20, 21, 23, 24, kami menjangkakan bahawa Ahli Parlimen hingga 5 µm boleh dilihat pada permukaan saluran udara trakea, contohnya, dengan menolak bingkai berturut-turut untuk melihat keterlihatan pergerakan MP yang lebih baik.MP tunggal 0.25 µm adalah lebih kecil daripada resolusi peranti pengimejan, tetapi PB-PCXI dijangka dapat mengesan kontras isipadu dan pergerakan cecair permukaan di mana ia dimendapkan selepas didepositkan.
Sampel untuk setiap MP dalam jadual.1 telah disediakan dalam kapilari kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) dengan diameter dalaman 0.63 mm.Zarah korpuskular tersedia dalam air, manakala zarah CombiMag tersedia dalam cecair proprietari pengeluar.Setiap tiub diisi separuh dengan cecair (kira-kira 11 µl) dan diletakkan pada pemegang sampel (lihat Rajah 1).Kapilari kaca diletakkan secara mendatar di atas pentas dalam ruang pengimejan, masing-masing, dan diletakkan di tepi cecair.Magnet cengkerang nikel berdiameter 19 mm (28 mm panjang) yang diperbuat daripada nadir bumi, neodymium, besi dan boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) dengan remanen 1.17 T telah dilekatkan pada sebuah jadual pemindahan berasingan untuk mencapai Tukar kedudukan anda dari jauh semasa rendering.Pengimejan sinar-X bermula apabila magnet diletakkan kira-kira 30 mm di atas sampel dan imej diperoleh pada 4 bingkai sesaat.Semasa pengimejan, magnet didekatkan dengan tiub kapilari kaca (pada jarak kira-kira 1 mm) dan kemudian digerakkan di sepanjang tiub untuk menilai kesan kekuatan medan dan kedudukan.
Persediaan pengimejan in vitro yang mengandungi sampel MP dalam kapilari kaca pada peringkat terjemahan sampel xy.Laluan pancaran X-ray ditandakan dengan garis putus-putus merah.
Setelah keterlihatan in vitro Ahli Parlimen ditubuhkan, subset daripada mereka telah diuji secara in vivo pada tikus albino Wistar betina jenis liar (~12 minggu, ~200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Jepun), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepun) dan butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Tikus telah dibius dengan campuran Pharma (Jepun) melalui suntikan intraperitoneal.Selepas anestesia, mereka disediakan untuk pengimejan dengan mengeluarkan bulu di sekeliling trakea, memasukkan tiub endotrakeal (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), dan melumpuhkannya dalam kedudukan terlentang pada plat pengimejan yang dibuat khas yang mengandungi beg termal. untuk mengekalkan suhu badan.22. Plat pengimejan kemudiannya dilekatkan pada peringkat sampel dalam kotak pengimejan pada sudut sedikit untuk menjajarkan trakea secara mendatar pada imej x-ray seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a.
(a) Persediaan pengimejan in vivo dalam unit pengimejan SPring-8, laluan pancaran sinar-X ditanda dengan garis putus-putus merah.( b, c ) Penyetempatan magnet trakea dilakukan dari jauh menggunakan dua kamera IP yang dipasang secara ortogon.Di sebelah kiri imej pada skrin, anda boleh melihat gelung wayar yang memegang kepala dan kanula penghantaran dipasang di dalam tiub ET.
Sistem pam picagari kawalan jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) menggunakan picagari kaca 100 µl telah disambungkan ke tiub PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) menggunakan jarum 30 Ga.Tandai tiub untuk memastikan bahawa hujung berada dalam kedudukan yang betul dalam trakea apabila memasukkan tiub endotrakeal.Menggunakan pam mikro, pelocok picagari dikeluarkan dan hujung tiub itu direndam dalam sampel MP yang akan dihantar.Tiub penghantaran yang dimuatkan kemudiannya dimasukkan ke dalam tiub endotrakeal, meletakkan hujung pada bahagian terkuat dari medan magnet terpakai yang kami jangkakan.Pemerolehan imej dikawal menggunakan pengesan nafas yang disambungkan ke kotak pemasaan berasaskan Arduino kami, dan semua isyarat (cth, suhu, pernafasan, pengatup buka/tutup dan pemerolehan imej) telah dirakam menggunakan Powerlab dan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Apabila Pengimejan Apabila perumah tidak tersedia, dua kamera IP (Panasonic BB-SC382) diletakkan pada kira-kira 90° antara satu sama lain dan digunakan untuk mengawal kedudukan magnet berbanding trakea semasa pengimejan (Rajah 2b, c).Untuk meminimumkan artifak gerakan, satu imej setiap nafas diperoleh semasa dataran tinggi aliran pernafasan terminal.
Magnet dilekatkan pada peringkat kedua, yang mungkin terletak jauh di bahagian luar badan pengimejan.Pelbagai kedudukan dan konfigurasi magnet telah diuji, termasuk: diletakkan pada sudut kira-kira 30° di atas trakea (konfigurasi ditunjukkan dalam Rajah 2a dan 3a);satu magnet di atas haiwan dan satu lagi di bawah, dengan kutub ditetapkan untuk tarikan (Rajah 3b)., satu magnet di atas haiwan dan satu di bawah, dengan kutub ditetapkan untuk tolakan (Rajah 3c), dan satu magnet di atas dan berserenjang dengan trakea (Rajah 3d).Selepas menyediakan haiwan dan magnet dan memuatkan MP yang sedang diuji ke dalam pam picagari, hantarkan dos 50 µl pada kadar 4 µl/saat selepas pemerolehan imej.Magnet kemudiannya digerakkan ke sana ke mari di sepanjang atau melintasi trakea sambil terus memperoleh imej.
Konfigurasi magnet untuk pengimejan in vivo (a) satu magnet di atas trakea pada sudut kira-kira 30°, (b) dua magnet dikonfigurasikan untuk tarikan, (c) dua magnet dikonfigurasikan untuk tolakan, (d) satu magnet di atas dan berserenjang dengan trakea.Pemerhati melihat ke bawah dari mulut ke paru-paru melalui trakea dan sinar X-ray melalui bahagian kiri tikus dan keluar dari bahagian kanan.Magnet sama ada digerakkan sepanjang saluran udara atau kiri dan kanan di atas trakea ke arah pancaran sinar-X.
Kami juga berusaha untuk menentukan keterlihatan dan kelakuan zarah dalam saluran udara tanpa adanya pencampuran pernafasan dan kadar denyutan jantung.Oleh itu, pada penghujung tempoh pengimejan, haiwan telah dibunuh secara manusiawi kerana overdosis pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, Amerika Syarikat; ~ 65 mg / kg ip).Sesetengah haiwan dibiarkan pada platform pengimejan, dan selepas pemberhentian pernafasan dan degupan jantung, proses pengimejan diulang, menambah dos tambahan MP jika tiada MP kelihatan pada permukaan saluran udara.
Imej yang terhasil telah diperbetulkan untuk medan rata dan gelap dan kemudian dipasang ke dalam filem (20 bingkai sesaat; 15–25 × kelajuan normal bergantung pada kadar pernafasan) menggunakan skrip tersuai yang ditulis dalam MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Semua kajian mengenai penghantaran vektor gen LV telah dijalankan di Pusat Penyelidikan Haiwan Makmal Universiti Adelaide dan bertujuan untuk menggunakan keputusan eksperimen SPring-8 untuk menilai sama ada penghantaran LV-MP dengan kehadiran medan magnet boleh meningkatkan pemindahan gen dalam vivo .Untuk menilai kesan MF dan medan magnet, dua kumpulan haiwan telah dirawat: satu kumpulan disuntik dengan LV MF dengan penempatan magnet, dan kumpulan lain disuntik dengan kumpulan kawalan dengan LV MF tanpa magnet.
Vektor gen LV telah dijana menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini 25, 26 .Vektor LacZ mengekspresikan gen beta-galactosidase setempat nuklear yang didorong oleh promoter konstitutif MPSV (LV-LacZ), yang menghasilkan produk tindak balas biru dalam sel transduksi, kelihatan pada bahagian hadapan dan bahagian tisu paru-paru.Pentitratan dilakukan dalam kultur sel dengan mengira bilangan sel positif LacZ secara manual menggunakan hemocytometer untuk mengira titer dalam TU/ml.Pembawa diawetkan pada suhu -80°C, dicairkan sebelum digunakan, dan diikat pada CombiMag dengan mencampurkan 1:1 dan mengeram pada ais selama sekurang-kurangnya 30 minit sebelum penghantaran.
Tikus Sprague Dawley biasa (n = 3/kumpulan, ~2-3 ip bius dengan campuran 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) dan 60mg/kg ketamin (Ilium, Australia) pada usia 1 bulan) ip ) suntikan dan kanulasi mulut bukan pembedahan dengan kanula intravena 16 Ga.Untuk memastikan bahawa tisu saluran udara trakea menerima transduksi LV, ia telah dikondisikan menggunakan protokol gangguan mekanikal yang telah diterangkan sebelum ini di mana permukaan saluran pernafasan trakea digosok secara paksi dengan bakul wayar (N-Circle, pengekstrak batu nitinol tanpa hujung NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, Amerika Syarikat) 30 p28.Kemudian, kira-kira 10 minit selepas gangguan dalam kabinet biokeselamatan, pentadbiran trakea LV-MP dilakukan.
Medan magnet yang digunakan dalam eksperimen ini dikonfigurasikan sama seperti kajian x-ray in vivo, dengan magnet yang sama dipegang di atas trakea dengan pengapit stent penyulingan (Rajah 4).Isipadu 50 µl (2 x 25 µl aliquot) LV-MP dihantar ke trakea (n = 3 haiwan) menggunakan pipet berujung gel seperti yang diterangkan sebelum ini.Kumpulan kawalan (n = 3 haiwan) menerima LV-MP yang sama tanpa menggunakan magnet.Selepas selesai infusi, kanula dikeluarkan dari tiub endotrakeal dan haiwan diekstubasi.Magnet kekal di tempatnya selama 10 minit sebelum dikeluarkan.Tikus diberi dos subkutan dengan meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) diikuti dengan pengeluaran anestesia dengan suntikan intraperitoneal 1 mg/kg atipamazole hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australia).Tikus disimpan hangat dan diperhatikan sehingga pulih sepenuhnya daripada anestesia.
Peranti penghantaran LV-MP dalam kabinet keselamatan biologi.Anda boleh melihat bahawa lengan kunci Luer kelabu muda tiub ET terkeluar dari mulut, dan hujung pipet gel yang ditunjukkan dalam rajah dimasukkan melalui tiub ET ke kedalaman yang dikehendaki ke dalam trakea.
Seminggu selepas prosedur pentadbiran LV-MP, haiwan dikorbankan secara manusiawi melalui penyedutan 100% CO2 dan ekspresi LacZ dinilai menggunakan rawatan X-gal standard kami.Tiga gelang rawan paling ekor telah dikeluarkan untuk memastikan bahawa sebarang kerosakan mekanikal atau pengekalan cecair akibat penempatan tiub endotrakeal tidak akan dimasukkan dalam analisis.Setiap trakea dipotong memanjang untuk mendapatkan dua bahagian untuk dianalisis dan diletakkan dalam cawan yang mengandungi getah silikon (Sylgard, Dow Inc) menggunakan jarum Minutien (Alat Sains Halus) untuk menggambarkan permukaan luminal.Taburan dan watak sel transduksi telah disahkan oleh fotografi hadapan menggunakan mikroskop Nikon (SMZ1500) dengan kamera DigiLite dan perisian TCapture (Tucsen Photonics, China).Imej diperoleh pada pembesaran 20x (termasuk tetapan maksimum untuk lebar penuh trakea), dengan keseluruhan panjang trakea dipaparkan langkah demi langkah, memberikan pertindihan yang cukup antara setiap imej untuk membolehkan imej "dijahit".Imej daripada setiap trakea kemudiannya digabungkan menjadi satu imej komposit menggunakan Editor Imej Komposit versi 2.0.3 (Microsoft Research) menggunakan algoritma gerakan satah. Kawasan ekspresi LacZ dalam imej komposit trakea daripada setiap haiwan dikira menggunakan skrip MATLAB automatik (R2020a, MathWorks) seperti yang diterangkan sebelum ini28, menggunakan tetapan 0.35 < Hue < 0.58, Ketepuan > 0.15, dan Nilai < 0.7. Kawasan ekspresi LacZ dalam imej komposit trakea daripada setiap haiwan dikira menggunakan skrip MATLAB automatik (R2020a, MathWorks) seperti yang diterangkan sebelum ini28, menggunakan tetapan 0.35 < Hue < 0.58, Ketepuan > 0.15, dan Nilai < 0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно оторедозлелельмис с о сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранеее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщензносать иение 0,35 <0,58, насыщенносить> 0 ,7. Luas ekspresi LacZ dalam imej trakea komposit daripada setiap haiwan dikira menggunakan skrip MATLAB automatik (R2020a, MathWorks) seperti yang diterangkan sebelum ini28 menggunakan tetapan 0.350.15 dan nilai<0 .7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中 茶行城，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图 的 訏使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 ....................... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с итонолозинароця MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 dan <0,7ние . Kawasan ekspresi LacZ pada imej komposit trakea setiap haiwan dikira menggunakan skrip MATLAB automatik (R2020a, MathWorks) seperti yang diterangkan sebelum ini menggunakan tetapan 0.35 < hue < 0.58, ketepuan > 0.15 dan nilai < 0.7 .Dengan menjejaki kontur tisu dalam GIMP v2.10.24, topeng dicipta secara manual untuk setiap imej komposit untuk mengenal pasti kawasan tisu dan mengelakkan sebarang pengesanan palsu di luar tisu trakea.Kawasan bernoda daripada semua imej komposit daripada setiap haiwan telah dijumlahkan untuk memberikan jumlah kawasan bernoda untuk haiwan itu.Kawasan yang dicat kemudiannya dibahagikan dengan jumlah kawasan topeng untuk mendapatkan kawasan normal.
Setiap trakea dibenamkan dalam parafin dan dipotong setebal 5 µm.Bahagian telah diwarnai balas dengan merah cepat neutral selama 5 minit dan imej diperoleh menggunakan mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 dan perisian tangkapan elemen NIS (versi 5.20.00).
Semua analisis statistik dilakukan dalam GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Kepentingan statistik ditetapkan pada p ≤ 0.05.Normaliti telah diuji menggunakan ujian Shapiro-Wilk dan perbezaan dalam pewarnaan LacZ dinilai menggunakan ujian-t tidak berpasangan.
Enam MP yang diterangkan dalam Jadual 1 telah diperiksa oleh PCXI, dan keterlihatan diterangkan dalam Jadual 2. Dua MP polistirena (MP1 dan MP2; 18 µm dan 0.25 µm, masing-masing) tidak dapat dilihat oleh PCXI, tetapi sampel yang tinggal dapat dikenal pasti (contoh ditunjukkan dalam Rajah 5).MP3 dan MP4 kelihatan lemah (masing-masing 10-15% Fe3O4; 0.25 µm dan 0.9 µm).Walaupun MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) mengandungi beberapa zarah terkecil yang diuji, ia adalah yang paling ketara.Produk CombiMag MP6 sukar untuk dibezakan.Dalam semua kes, keupayaan kami untuk mengesan MF telah bertambah baik dengan menggerakkan magnet ke sana ke mari selari dengan kapilari.Apabila magnet bergerak menjauhi kapilari, zarah ditarik keluar dalam rantai panjang, tetapi apabila magnet menghampiri dan kekuatan medan magnet meningkat, rantai zarah memendek apabila zarah berhijrah ke arah permukaan atas kapilari (lihat Video Tambahan S1 : MP4), meningkatkan ketumpatan zarah pada permukaan.Sebaliknya, apabila magnet dikeluarkan daripada kapilari, kekuatan medan berkurangan dan Ahli Parlimen menyusun semula menjadi rantai panjang yang memanjang dari permukaan atas kapilari (lihat Video Tambahan S2: MP4).Selepas magnet berhenti bergerak, zarah-zarah terus bergerak untuk beberapa lama selepas mencapai kedudukan keseimbangan.Apabila MP bergerak ke arah dan menjauhi permukaan atas kapilari, zarah magnet cenderung untuk menarik serpihan melalui cecair.
Keterlihatan MP di bawah PCXI sangat berbeza antara sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6.Semua imej yang ditunjukkan di sini diambil dengan magnet yang diletakkan kira-kira 10 mm tepat di atas kapilari.Bulatan besar yang ketara ialah gelembung udara yang terperangkap dalam kapilari, dengan jelas menunjukkan ciri tepi hitam dan putih bagi imej kontras fasa.Kotak merah menunjukkan pembesaran yang meningkatkan kontras.Perhatikan bahawa diameter litar magnet dalam semua rajah tidak mengikut skala dan lebih kurang 100 kali lebih besar daripada yang ditunjukkan.
Apabila magnet bergerak ke kiri dan ke kanan di sepanjang bahagian atas kapilari, sudut rentetan MP berubah untuk sejajar dengan magnet (lihat Rajah 6), dengan itu menggambarkan garis medan magnet.Untuk MP3-5, selepas kord mencapai sudut ambang, zarah menyeret sepanjang permukaan atas kapilari.Ini selalunya mengakibatkan ahli parlimen berkumpul ke dalam kumpulan yang lebih besar berhampiran tempat medan magnet paling kuat (lihat Video Tambahan S3: MP5).Ini juga amat ketara apabila pengimejan berhampiran dengan hujung kapilari, yang menyebabkan MP berkumpul dan menumpukan pada antara muka cecair-udara.Zarah dalam MP6, yang lebih sukar untuk dibezakan berbanding dalam MP3-5, tidak menyeret apabila magnet bergerak di sepanjang kapilari, tetapi rentetan MP tercerai, meninggalkan zarah dalam pandangan (lihat Video Tambahan S4: MP6).Dalam sesetengah kes, apabila medan magnet yang digunakan dikurangkan dengan menggerakkan magnet pada jarak yang jauh dari tapak pengimejan, mana-mana Ahli Parlimen yang tinggal perlahan-lahan turun ke permukaan bawah tiub mengikut graviti, kekal dalam rentetan (lihat Video Tambahan S5: MP3) .
Sudut rentetan MP berubah apabila magnet bergerak ke kanan di atas kapilari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6.Kotak merah menunjukkan pembesaran yang meningkatkan kontras.Sila ambil perhatian bahawa video tambahan adalah untuk tujuan maklumat kerana ia mendedahkan struktur zarah penting dan maklumat dinamik yang tidak dapat digambarkan dalam imej statik ini.
Ujian kami telah menunjukkan bahawa menggerakkan magnet ke sana ke mari secara perlahan di sepanjang trakea memudahkan visualisasi MF dalam konteks pergerakan kompleks dalam vivo.Tiada ujian in vivo dilakukan kerana manik polistirena (MP1 dan MP2) tidak kelihatan dalam kapilari.Setiap empat baki MF diuji secara in vivo dengan paksi panjang magnet diletakkan di atas trakea pada sudut kira-kira 30° ke menegak (lihat Rajah 2b dan 3a), kerana ini menghasilkan rantaian MF yang lebih panjang dan lebih berkesan. daripada magnet..konfigurasi ditamatkan.MP3, MP4 dan MP6 tidak ditemui dalam trakea mana-mana haiwan hidup.Apabila menggambarkan saluran pernafasan tikus selepas membunuh haiwan secara manusiawi, zarah-zarah tersebut kekal tidak kelihatan walaupun isipadu tambahan ditambah menggunakan pam picagari.MP5 mempunyai kandungan oksida besi tertinggi dan merupakan satu-satunya zarah yang kelihatan, jadi ia digunakan untuk menilai dan mencirikan tingkah laku MP dalam vivo.
Peletakan magnet di atas trakea semasa pemasukan MF menyebabkan banyak, tetapi tidak semua, MF tertumpu dalam bidang pandangan.Kemasukan zarah trakea paling baik diperhatikan pada haiwan yang dibunuh secara manusiawi.Rajah 7 dan Video Tambahan S6: MP5 menunjukkan tangkapan magnet pantas dan penjajaran zarah pada permukaan trakea ventral, menunjukkan bahawa Ahli Parlimen boleh disasarkan ke kawasan trakea yang dikehendaki.Apabila mencari lebih jauh di sepanjang trakea selepas penghantaran MF, beberapa MF ditemui lebih dekat dengan carina, yang menunjukkan kekuatan medan magnet yang tidak mencukupi untuk mengumpul dan menahan semua MF, kerana ia dihantar melalui kawasan kekuatan medan magnet maksimum semasa pentadbiran bendalir.proses.Walau bagaimanapun, kepekatan MP selepas bersalin adalah lebih tinggi di sekitar kawasan imej, menunjukkan bahawa ramai MP kekal di kawasan saluran udara di mana kekuatan medan magnet yang digunakan adalah tertinggi.
Imej (a) sebelum dan (b) selepas penghantaran MP5 ke dalam trakea tikus yang baru disingkirkan dengan magnet diletakkan tepat di atas kawasan pengimejan.Kawasan yang digambarkan terletak di antara dua cincin tulang rawan.Terdapat sedikit cecair dalam saluran pernafasan sebelum MP dihantar.Kotak merah menunjukkan pembesaran yang meningkatkan kontras.Imej ini diambil daripada video yang dipaparkan dalam S6: Video Tambahan MP5.
Menggerakkan magnet di sepanjang trakea dalam vivo mengakibatkan perubahan dalam sudut rantai MP pada permukaan saluran udara, sama seperti yang diperhatikan dalam kapilari (lihat Rajah 8 dan Video Tambahan S7: MP5).Walau bagaimanapun, dalam kajian kami, Ahli Parlimen tidak boleh diseret di sepanjang permukaan saluran pernafasan hidup, seperti yang boleh dilakukan oleh kapilari.Dalam sesetengah kes, rantai MP memanjang apabila magnet bergerak ke kiri dan ke kanan.Menariknya, kami juga mendapati bahawa rantai zarah mengubah kedalaman lapisan permukaan bendalir apabila magnet digerakkan secara membujur sepanjang trakea, dan mengembang apabila magnet digerakkan terus ke atas dan rantai zarah diputar ke kedudukan menegak (lihat Video Tambahan S7).: MP5 pada 0:09, bahagian bawah kanan).Corak pergerakan ciri berubah apabila magnet digerakkan secara sisi melintasi bahagian atas trakea (iaitu, ke kiri atau kanan haiwan, bukannya sepanjang trakea).Zarah masih kelihatan jelas semasa pergerakannya, tetapi apabila magnet dikeluarkan dari trakea, hujung rentetan zarah menjadi kelihatan (lihat Video Tambahan S8: MP5, bermula pada 0:08).Ini bersetuju dengan kelakuan medan magnet yang diperhatikan di bawah tindakan medan magnet yang digunakan dalam kapilari kaca.
Contoh imej yang menunjukkan MP5 dalam trakea tikus yang dibius hidup.(a) Magnet digunakan untuk memperoleh imej di atas dan di sebelah kiri trakea, kemudian (b) selepas menggerakkan magnet ke kanan.Kotak merah menunjukkan pembesaran yang meningkatkan kontras.Imej ini adalah daripada video yang dipaparkan dalam Video Tambahan S7: MP5.
Apabila kedua-dua kutub ditala dalam orientasi utara-selatan di atas dan di bawah trakea (iaitu, menarik; Rajah 3b), kord MP kelihatan lebih panjang dan terletak pada dinding sisi trakea dan bukannya pada permukaan dorsal trakea. trakea (lihat Lampiran).Video S9:MP5).Walau bagaimanapun, kepekatan zarah yang tinggi di satu tapak (iaitu, permukaan dorsal trakea) tidak dikesan selepas pemberian cecair menggunakan peranti dwi magnet, yang biasanya berlaku dengan peranti magnet tunggal.Kemudian, apabila satu magnet dikonfigurasikan untuk menangkis kutub bertentangan (Rajah 3c), bilangan zarah yang kelihatan dalam medan pandangan tidak meningkat selepas penghantaran.Menyediakan kedua-dua konfigurasi magnet adalah mencabar kerana kekuatan medan magnet yang tinggi yang masing-masing menarik atau menolak magnet.Persediaan kemudiannya ditukar kepada magnet tunggal yang selari dengan saluran udara tetapi melalui saluran udara pada sudut 90 darjah supaya garis daya melintasi dinding trakea secara ortogon (Rajah 3d), orientasi bertujuan untuk menentukan kemungkinan pengagregatan zarah pada dinding sisi.diperhatikan.Walau bagaimanapun, dalam konfigurasi ini, tiada pergerakan pengumpulan MF atau pergerakan magnet yang boleh dikenal pasti.Berdasarkan semua keputusan ini, konfigurasi dengan magnet tunggal dan orientasi 30 darjah telah dipilih untuk kajian in vivo pembawa gen (Rajah 3a).
Apabila haiwan itu diimej beberapa kali sejurus selepas dikorbankan secara manusiawi, ketiadaan pergerakan tisu yang mengganggu bermakna garis zarah yang lebih halus dan lebih pendek dapat dilihat dalam medan intercartilaginous yang jelas, 'bergoyang' mengikut gerakan translasi magnet.melihat dengan jelas kehadiran dan pergerakan zarah MP6.
Titer LV-LacZ ialah 1.8 x 108 IU/mL, dan selepas mencampurkan 1:1 dengan CombiMag MP (MP6), haiwan disuntik dengan 50 µl dos trakea 9 x 107 IU/ml kenderaan LV (iaitu 4.5 x 106 TU/tikus).)).Dalam kajian ini, daripada menggerakkan magnet semasa bersalin, kami membetulkan magnet dalam satu kedudukan untuk menentukan sama ada transduksi LV boleh (a) diperbaiki berbanding penghantaran vektor tanpa adanya medan magnet, dan (b) jika saluran udara boleh fokus.Sel-sel yang ditransduksi di kawasan sasaran magnetik saluran pernafasan atas.
Kehadiran magnet dan penggunaan CombiMag dalam kombinasi dengan vektor LV nampaknya tidak menjejaskan kesihatan haiwan, seperti juga protokol penghantaran vektor LV standard kami.Imej hadapan kawasan trakea yang mengalami gangguan mekanikal (Tambahan Rajah 1) menunjukkan bahawa kumpulan yang dirawat LV-MP mempunyai tahap transduksi yang lebih tinggi dengan kehadiran magnet (Rajah 9a).Hanya sejumlah kecil pewarnaan LacZ biru hadir dalam kumpulan kawalan (Rajah 9b).Kuantifikasi kawasan normal yang diwarnai X-Gal menunjukkan bahawa pentadbiran LV-MP dengan kehadiran medan magnet menghasilkan peningkatan kira-kira 6 kali ganda (Rajah 9c).
Contoh imej komposit yang menunjukkan transduksi trakea dengan LV-MP (a) dengan kehadiran medan magnet dan (b) tanpa ketiadaan magnet.(c) Peningkatan ketara secara statistik dalam kawasan normal transduksi LacZ dalam trakea dengan penggunaan magnet (*p = 0.029, ujian-t, n = 3 setiap kumpulan, min ± ralat piawai min).
Bahagian bernoda merah cepat neutral (contoh ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 2) menunjukkan bahawa sel bernoda LacZ hadir dalam sampel yang sama dan di lokasi yang sama seperti yang dilaporkan sebelum ini.
Cabaran utama dalam terapi gen saluran udara kekal sebagai penyetempatan tepat zarah pembawa di kawasan yang diminati dan pencapaian tahap kecekapan transduksi yang tinggi dalam paru-paru mudah alih dengan kehadiran aliran udara dan pelepasan lendir aktif.Bagi pembawa LV yang bertujuan untuk rawatan penyakit pernafasan dalam fibrosis kistik, meningkatkan masa tinggal zarah pembawa dalam saluran udara konduktif sehingga kini menjadi matlamat yang tidak dapat dicapai.Seperti yang ditunjukkan oleh Castellani et al., penggunaan medan magnet untuk meningkatkan transduksi mempunyai kelebihan berbanding kaedah penghantaran gen lain seperti elektroporasi kerana ia boleh menggabungkan kesederhanaan, ekonomi, penghantaran setempat, peningkatan kecekapan, dan masa inkubasi yang lebih pendek.dan mungkin dos kenderaan yang lebih rendah10.Walau bagaimanapun, pemendapan in vivo dan kelakuan zarah magnet dalam saluran udara di bawah pengaruh daya magnet luar tidak pernah diterangkan, dan sebenarnya keupayaan kaedah ini untuk meningkatkan tahap ekspresi gen dalam saluran udara hidup yang utuh belum ditunjukkan dalam vivo.
Eksperimen in vitro kami pada synchrotron PCXI menunjukkan bahawa semua zarah yang kami uji, kecuali polistirena MP, boleh dilihat dalam persediaan pengimejan yang kami gunakan.Dengan adanya medan magnet, medan magnet membentuk rentetan, yang panjangnya berkaitan dengan jenis zarah dan kekuatan medan magnet (iaitu, kedekatan dan pergerakan magnet).Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 10, rentetan yang kita perhatikan terbentuk apabila setiap zarah individu menjadi magnet dan mendorong medan magnet tempatannya sendiri.Medan berasingan ini menyebabkan zarah lain yang serupa berkumpul dan bersambung dengan gerakan rentetan kumpulan disebabkan oleh daya tempatan daripada daya tarikan tempatan dan tolakan zarah lain.
Rajah menunjukkan (a, b) rantai zarah yang terbentuk di dalam kapilari berisi bendalir dan (c, d) trakea berisi udara.Perhatikan bahawa kapilari dan trakea tidak dilukis mengikut skala.Panel (a) juga mengandungi penerangan tentang MF yang mengandungi zarah Fe3O4 yang disusun dalam rantai.
Apabila magnet bergerak ke atas kapilari, sudut rentetan zarah mencapai ambang kritikal untuk MP3-5 yang mengandungi Fe3O4, selepas itu rentetan zarah tidak lagi kekal dalam kedudukan asalnya, tetapi bergerak di sepanjang permukaan ke kedudukan baru.magnet.Kesan ini mungkin berlaku kerana permukaan kapilari kaca cukup licin untuk membolehkan pergerakan ini berlaku.Menariknya, MP6 (CombiMag) tidak berkelakuan seperti ini, mungkin kerana zarahnya lebih kecil, mempunyai salutan atau caj permukaan yang berbeza, atau cecair pembawa proprietari menjejaskan keupayaan mereka untuk bergerak.Kontras dalam imej zarah CombiMag juga lebih lemah, menunjukkan bahawa cecair dan zarah mungkin mempunyai ketumpatan yang sama dan oleh itu tidak boleh bergerak ke arah satu sama lain dengan mudah.Zarah juga boleh tersangkut jika magnet bergerak terlalu cepat, menunjukkan bahawa kekuatan medan magnet tidak selalu dapat mengatasi geseran antara zarah dalam bendalir, menunjukkan bahawa kekuatan medan magnet dan jarak antara magnet dan kawasan sasaran tidak sepatutnya datang sebagai kejutan.penting.Keputusan ini juga menunjukkan bahawa walaupun magnet boleh menangkap banyak zarah mikro yang mengalir melalui kawasan sasaran, tidak mungkin magnet boleh dipercayai untuk menggerakkan zarah CombiMag di sepanjang permukaan trakea.Oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa kajian in vivo LV MF harus menggunakan medan magnet statik untuk menyasarkan secara fizikal kawasan tertentu pokok saluran pernafasan.
Sebaik sahaja zarah dihantar ke dalam badan, ia sukar dikenal pasti dalam konteks tisu bergerak kompleks badan, tetapi keupayaan pengesanan mereka telah dipertingkatkan dengan menggerakkan magnet secara mendatar di atas trakea untuk "menggoyangkan" rentetan MP.Walaupun pengimejan masa nyata boleh dilakukan, lebih mudah untuk membezakan pergerakan zarah selepas haiwan itu dibunuh secara manusiawi.Kepekatan MP biasanya paling tinggi di lokasi ini apabila magnet diletakkan di atas kawasan pengimejan, walaupun sesetengah zarah biasanya ditemui lebih jauh ke bawah trakea.Tidak seperti kajian in vitro, zarah tidak boleh diseret ke bawah trakea dengan pergerakan magnet.Penemuan ini konsisten dengan bagaimana lendir yang menutupi permukaan trakea biasanya memproses zarah yang disedut, memerangkapnya dalam lendir dan seterusnya membersihkannya melalui mekanisme pembersihan muko-ciliary.
Kami membuat hipotesis bahawa menggunakan magnet di atas dan di bawah trakea untuk tarikan (Rajah 3b) boleh menghasilkan medan magnet yang lebih seragam, dan bukannya medan magnet yang sangat tertumpu pada satu titik, yang berpotensi menghasilkan pengedaran zarah yang lebih seragam..Walau bagaimanapun, kajian awal kami tidak menemui bukti yang jelas untuk menyokong hipotesis ini.Begitu juga, menetapkan sepasang magnet untuk menolak (Rajah 3c) tidak menyebabkan lebih banyak zarah termendap dalam kawasan imej.Kedua-dua penemuan ini menunjukkan bahawa persediaan dwi-magnet tidak meningkatkan kawalan tempatan penunjuk MP dengan ketara, dan bahawa daya magnet kuat yang terhasil sukar untuk ditala, menjadikan pendekatan ini kurang praktikal.Begitu juga, mengorientasikan magnet di atas dan merentasi trakea (Rajah 3d) juga tidak meningkatkan bilangan zarah yang tinggal di kawasan yang diimej.Beberapa konfigurasi alternatif ini mungkin tidak berjaya kerana ia mengakibatkan pengurangan kekuatan medan magnet dalam zon pemendapan.Oleh itu, konfigurasi magnet tunggal pada 30 darjah (Rajah 3a) dianggap sebagai kaedah ujian in vivo yang paling mudah dan berkesan.
Kajian LV-MP menunjukkan bahawa apabila vektor LV digabungkan dengan CombiMag dan dihantar selepas diganggu secara fizikal dengan kehadiran medan magnet, tahap transduksi meningkat dengan ketara dalam trakea berbanding dengan kawalan.Berdasarkan kajian pengimejan synchrotron dan keputusan LacZ, medan magnet kelihatan dapat mengekalkan LV dalam trakea dan mengurangkan bilangan zarah vektor yang serta-merta menembusi jauh ke dalam paru-paru.Penambahbaikan penyasaran sedemikian boleh membawa kepada kecekapan yang lebih tinggi sambil mengurangkan titer yang dihantar, transduksi tidak disasarkan, kesan sampingan keradangan dan imun serta kos pemindahan gen.Yang penting, menurut pengilang, CombiMag boleh digunakan dalam kombinasi dengan kaedah pemindahan gen lain, termasuk vektor virus lain (seperti AAV) dan asid nukleik.