Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Toxoplasma gondii ialah parasit protozoa intraselular yang memodulasi persekitaran mikro perumah yang dijangkiti dan diketahui dikaitkan dengan kejadian pertumbuhan tumor otak.Dalam kajian ini, kami membuat hipotesis bahawa miRNA-21 eksosomal daripada jangkitan Toxoplasma menggalakkan pertumbuhan tumor otak.Eksosom daripada mikroglia BV2 yang dijangkiti Toxoplasma telah dicirikan dan dalaman sel glioma U87 telah disahkan.Profil ekspresi mikroRNA eksosomal dianalisis menggunakan tatasusunan mikroRNA dan mikroRNA-21A-5p yang dikaitkan dengan Toxoplasma gondii dan pengisihan tumor.Kami juga menyiasat tahap mRNA gen yang berkaitan dengan tumor dalam sel glioma U87 dengan mengubah tahap miR-21 dalam eksosom dan kesan eksosom pada percambahan sel glioma U87 manusia.Dalam eksosom sel glioma U87 yang dijangkiti Toxoplasma gondii, ekspresi mikroRNA-21 meningkat dan aktiviti gen antitumor (FoxO1, PTEN, dan PDCD4) dikurangkan.Eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti Toxoplasma mendorong pembiakan sel glioma U87.Eksosom mendorong pertumbuhan sel U87 dalam model tumor tikus.Kami mencadangkan bahawa peningkatan miR-21 eksosomal dalam mikroglia BV2 yang dijangkiti Toxoplasma mungkin memainkan peranan penting sebagai penggalak pertumbuhan sel dalam sel glioma U87 dengan merendahkan gen antitumor.
Dianggarkan lebih daripada 18.1 juta kes kanser lanjutan telah didiagnosis di seluruh dunia pada tahun 2018, dengan kira-kira 297,000 tumor sistem saraf pusat didiagnosis setiap tahun (1.6% daripada semua tumor)1.Penyelidikan terdahulu telah menunjukkan bahawa faktor risiko untuk membangunkan tumor otak manusia termasuk pelbagai produk kimia, sejarah keluarga, dan sinaran mengion daripada peralatan terapeutik dan diagnostik kepala.Walau bagaimanapun, punca sebenar keganasan ini tidak diketahui.Kira-kira 20% daripada semua kanser di seluruh dunia disebabkan oleh agen berjangkit, termasuk virus, bakteria dan parasit3,4.Patogen berjangkit mengganggu mekanisme genetik sel perumah, seperti pembaikan DNA dan kitaran sel, dan boleh menyebabkan keradangan kronik dan kerosakan pada sistem imun5.
Ejen berjangkit yang dikaitkan dengan kanser manusia adalah patogen virus yang paling biasa, termasuk papillomavirus manusia dan virus hepatitis B dan C.Parasit juga boleh memainkan peranan yang berpotensi dalam perkembangan kanser manusia.Beberapa spesies parasit, iaitu Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis dan Hymenolepis nana, telah terlibat dalam pelbagai jenis kanser manusia 6,7,8.
Toxoplasma gondii ialah protozoa intraselular yang mengawal persekitaran mikro sel perumah yang dijangkiti.Parasit ini dianggarkan menjangkiti kira-kira 30% daripada populasi dunia, meletakkan seluruh populasi dalam risiko9,10.Toxoplasma gondii boleh menjangkiti organ-organ penting, termasuk sistem saraf pusat (CNS), dan menyebabkan penyakit serius seperti meningitis dan ensefalitis yang boleh membawa maut, terutamanya pada pesakit yang lemah imun9.Walau bagaimanapun, Toxoplasma gondii juga boleh mengubah persekitaran perumah yang dijangkiti dengan memodulasi pertumbuhan sel dan tindak balas imun dalam individu imunokompeten, yang membawa kepada pengekalan jangkitan kronik tanpa gejala9,11.Menariknya, memandangkan korelasi antara prevalens T. gondii dan kejadian tumor otak, beberapa laporan mencadangkan bahawa perubahan persekitaran hos in vivo akibat jangkitan T. gondii kronik menyerupai persekitaran mikro tumor.
Eksosom dikenali sebagai komunikator antara sel yang menyampaikan kandungan biologi, termasuk protein dan asid nukleik, daripada sel jiran16,17.Eksosom boleh mempengaruhi proses biologi berkaitan tumor seperti anti-apoptosis, angiogenesis, dan metastasis dalam persekitaran mikro tumor.Khususnya, miRNA (miRNAs), RNA bukan pengekodan kecil kira-kira 22 nukleotida panjangnya, adalah pengawal selia gen pasca-transkrip yang penting yang mengawal lebih daripada 30% mRNA manusia melalui kompleks pembungkaman yang disebabkan oleh miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii boleh mengganggu proses biologi dengan mengawal ekspresi miRNA dalam perumah yang dijangkiti.MiRNA hos mengandungi isyarat penting untuk mengawal selia proses biologi tuan rumah untuk mencapai strategi survival parasit.Oleh itu, mengkaji perubahan dalam profil miRNA hos apabila jangkitan dengan T. gondii boleh membantu kita memahami interaksi antara hos dan T. gondii dengan lebih jelas.Sesungguhnya, Thirugnanam et al.15 mencadangkan bahawa T. gondii menggalakkan karsinogenesis otak dengan mengubah ekspresinya pada miRNA hos tertentu yang dikaitkan dengan pertumbuhan tumor dan mendapati bahawa T. gondii boleh menyebabkan glioma dalam haiwan eksperimen.
Kajian ini memberi tumpuan kepada pengubahan miR-21 eksosomal dalam mikroglia tuan rumah yang dijangkiti Toxoplasma BV2.Kami melihat kemungkinan peranan miR-21 eksosomal yang diubah dalam pertumbuhan sel glioma U87 disebabkan oleh pengekalan dalam nukleus FoxO1 / p27, yang merupakan sasaran miR-21 yang terlalu tertekan.
Eksosom yang diperoleh daripada BV2 diperoleh menggunakan sentrifugasi pembezaan dan disahkan dengan pelbagai kaedah untuk mencegah pencemaran dengan komponen selular atau vesikel lain.Elektroforesis gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) menunjukkan corak yang berbeza antara protein yang diekstrak daripada sel BV2 dan eksosom (Rajah 1A), dan sampel dinilai untuk kehadiran Alix, yang dianalisis oleh pembongkaran Barat penanda protein eksosomal dalam .Pelabelan Alix ditemui dalam protein eksosom tetapi tidak dalam protein lisat sel BV2 (Rajah 1B).Di samping itu, RNA yang telah disucikan daripada eksosom yang diperoleh daripada BV2 dianalisis menggunakan bioanalyzer.Subunit ribosom 18S dan 28S jarang diperhatikan dalam corak penghijrahan RNA eksosomal, menunjukkan ketulenan yang boleh dipercayai (Rajah 1C).Akhir sekali, mikroskop elektron penghantaran menunjukkan bahawa eksosom yang diperhatikan bersaiz kira-kira 60-150 nm dan mempunyai struktur seperti cawan tipikal morfologi eksosom (Rajah 1D).
Pencirian eksosom yang diperoleh daripada sel BV2.(A) Halaman helaian data keselamatan.Protein diasingkan daripada sel BV2 atau eksosom yang diperoleh daripada BV2.Corak protein berbeza antara sel dan eksosom.(B) Analisis blot Barat bagi penanda eksosomal (Alix).(C) Penilaian RNA yang telah disucikan daripada sel BV2 dan eksosom terbitan BV2 menggunakan bioanalyzer.Oleh itu, subunit ribosom 18S dan 28S dalam sel BV2 jarang ditemui dalam RNA eksosomal.(D) Mikroskopi elektron penghantaran menunjukkan bahawa eksosom yang diasingkan daripada sel BV2 diwarnakan secara negatif dengan 2% uranil asetat.Exosom bersaiz kira-kira 60-150 nm dan berbentuk cawan (Song dan Jung, data tidak diterbitkan).
Internalisasi selular exosom yang berasal dari BV2 ke dalam sel glioma manusia U87 diperhatikan menggunakan mikroskop confocal.Eksosom berlabel PKH26 disetempat dalam sitoplasma sel U87.Nukleus telah diwarnai dengan DAPI (Rajah 2A), menunjukkan bahawa eksosom yang berasal dari BV2 boleh dihayati oleh sel perumah dan mempengaruhi persekitaran sel penerima.
Penyertaan eksosom terbitan BV2 ke dalam sel glioma U87 dan eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti Toxoplasma RH akibat percambahan sel glioma U87.(A) Eksosom yang diselubungi oleh sel U87 yang diukur dengan mikroskop confocal.Sel glioma U87 diinkubasi dengan eksosom yang dilabelkan dengan PKH26 (merah) atau tanpa kawalan selama 24 jam.Nukleus telah diwarnai dengan DAPI (biru) dan kemudian diperhatikan di bawah mikroskop confocal (bar skala: 10 μm, x 3000).(B) Percambahan sel glioma U87 ditentukan oleh ujian proliferasi sel.Sel glioma U87 telah dirawat dengan eksosom untuk masa yang dinyatakan. *P <0.05 diperolehi dengan ujian t Pelajar. *P <0.05 diperolehi dengan ujian t Pelajar. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0.05 mengikut ujian-t Pelajar. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 diperoleh menggunakan ujian-t Pelajar.
Selepas mengesahkan penghayatan exosom yang berasal dari BV2 ke dalam sel glioma U87, kami melakukan ujian percambahan sel untuk menyiasat peranan exosom yang berasal dari Toxoplasma yang berasal dari BV2 dalam pembangunan sel glioma manusia.Rawatan sel U87 dengan eksosom daripada sel BV2 yang dijangkiti T. gondii menunjukkan bahawa eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti T. gondii menyebabkan percambahan sel U87 yang jauh lebih tinggi berbanding kawalan (Rajah 2B).
Di samping itu, pertumbuhan sel U118 mempunyai keputusan yang sama seperti U87, kerana Toxoplasma merangsang eksosom menyebabkan tahap percambahan tertinggi (data tidak ditunjukkan).Berdasarkan data ini, kita boleh menunjukkan bahawa exosom yang dijangkiti Toxoplasma yang berasal dari BV2 memainkan peranan penting dalam percambahan sel glioma.
Untuk menyiasat kesan eksosom BV2 yang dijangkiti Toxoplasma terhadap perkembangan tumor, kami menyuntik sel glioma U87 ke dalam tikus bogel untuk model xenograf dan menyuntik eksosom terbitan BV2 atau eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti RH.Selepas tumor menjadi jelas selepas 1 minggu, setiap kumpulan eksperimen 5 tikus dibahagikan mengikut saiz tumor untuk menentukan titik permulaan yang sama, dan saiz tumor diukur selama 22 hari.
Pada tikus dengan model xenograf U87, saiz dan berat tumor yang jauh lebih besar diperhatikan dalam kumpulan eksosom yang dijangkiti RH BV2 pada hari ke-22 (Rajah 3A, B).Sebaliknya, tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam saiz tumor antara kumpulan exosome yang berasal dari BV2 dan kumpulan kawalan selepas rawatan exosome.Di samping itu, tikus yang disuntik dengan sel glioma dan eksosom secara visual memaparkan jumlah tumor terbesar dalam kumpulan eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti RH (Rajah 3C).Keputusan ini menunjukkan bahawa exosom yang dijangkiti Toxoplasma yang berasal dari BV2 mendorong pertumbuhan glioma dalam model tumor tikus.
Onkogenesis (AC) exosom yang diperolehi BV2 dalam model tetikus xenograf U87.Saiz tumor (A) dan berat (B) meningkat dengan ketara dalam tikus bogel BALB/c yang dirawat dengan eksosom yang dijangkiti RH yang diperoleh daripada BV2.BALB/c tikus bogel (C) disuntik secara subkutan dengan 1 x 107 sel U87 yang digantung dalam campuran Matrigel.Enam hari selepas suntikan, 100 μg exosom yang berasal dari BV2 telah dirawat pada tikus.Saiz dan berat tumor diukur pada hari yang dinyatakan dan selepas pengorbanan, masing-masing. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05.
Data menunjukkan bahawa 37 miRNA (16 overexpressed dan 21 downexpressed) yang dikaitkan dengan imuniti atau perkembangan tumor telah diubah dengan ketara dalam mikroglia selepas jangkitan dengan strain Toxoplasma RH (Rajah 4A).Tahap ekspresi relatif miR-21 di kalangan miRNA yang diubah telah disahkan oleh RT-PCR masa nyata dalam eksosom yang diperoleh daripada BV2, eksosom yang dirawat dengan sel BV2 dan U87.Ungkapan miR-21 menunjukkan peningkatan ketara dalam eksosom daripada sel BV2 yang dijangkiti Toxoplasma gondii (strain RH) (Rajah 4B).Tahap ekspresi relatif miR-21 dalam sel BV2 dan U87 meningkat selepas pengambilan eksosom yang diubah (Rajah 4B).Tahap relatif ekspresi miR-21 dalam tisu otak pesakit tumor dan tikus yang dijangkiti Toxoplasma gondii (strain ME49) adalah lebih tinggi daripada kawalan, masing-masing (Rajah 4C).Keputusan ini berkorelasi dengan perbezaan antara tahap ekspresi mikroRNA yang diramalkan dan disahkan secara in vitro dan in vivo.
Perubahan dalam ekspresi exosomal miP-21a-5p dalam mikroglia yang dijangkiti Toxoplasma gondii (RH).(A) Menunjukkan perubahan ketara dalam siRNA yang berkaitan dengan imuniti atau perkembangan tumor berikutan jangkitan T. gondii RH.(B) Tahap ekspresi miR-21 relatif telah dikesan oleh RT-PCR masa nyata dalam eksosom terbitan BV2, eksosom yang dirawat BV2 dan sel U87.(C) Tahap ekspresi miR-21 relatif didapati dalam tisu otak pesakit tumor (N=3) dan tikus yang dijangkiti Toxoplasma gondii (strain ME49) (N=3). *P <0.05 diperolehi dengan ujian t Pelajar. *P <0.05 diperolehi dengan ujian t Pelajar. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 diperolehi menggunakan ujian-t Pelajar. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 diperoleh menggunakan ujian-t Pelajar.
Eksosom daripada sel BV2 yang dijangkiti RH membawa kepada pertumbuhan glioma dalam vivo dan in vitro (Rajah 2, 3).Untuk mengesan mRNA yang berkaitan, kami memeriksa tahap mRNA gen sasaran antitumor, kotak forkhead O1 (FoxO1), PTEN, dan kematian sel yang diprogramkan 4 (PDCD4) dalam sel U87 yang dijangkiti exosom yang berasal daripada BV2 atau RH BV2.Analisis bioinformatik telah menunjukkan bahawa beberapa gen yang berkaitan dengan tumor, termasuk gen FoxO1, PTEN, dan PDCD4, mempunyai tapak pengikat miR-2121,22.Tahap mRNA gen sasaran antitumor telah dikurangkan dalam eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti RH berbanding eksosom terbitan BV2 (Rajah 5A).FoxO1 menunjukkan tahap protein yang berkurangan dalam eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti RH berbanding eksosom yang diperolehi BV2 (Rajah 5B).Berdasarkan keputusan ini, kami boleh mengesahkan bahawa eksosom yang diperoleh daripada BV2 yang dijangkiti RH menurunkan kawalan gen anti-onkogenik, mengekalkan peranannya dalam pertumbuhan tumor.
Eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti Toxoplasma RH mendorong penindasan gen antitumor dalam sel glioma U87 oleh eksosom terbitan BV2 yang dijangkiti Toxoplasma RH.(A) PCR masa nyata ekspresi FoxO1, PTEN dan PDCD4 dalam eksosom yang diperoleh daripada BV2 yang dijangkiti T. gondii RH berbanding eksosom PBS.mRNA β-actin digunakan sebagai kawalan.( B ) Ekspresi FoxO1 ditentukan oleh Western blotting dan data densitometri dinilai secara statistik menggunakan program ImageJ. *P <0.05 diperolehi dengan ujian t Pelajar. *P <0.05 diperolehi dengan ujian t Pelajar. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 diperolehi menggunakan ujian-t Pelajar. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 diperoleh menggunakan ujian-t Pelajar.
Untuk memahami kesan miP-21 dalam eksosom pada peraturan gen yang berkaitan dengan tumor, sel U87 telah ditransfeksi dengan perencat miP-21 menggunakan Lipofectamine 2000 dan sel telah dituai 24 jam selepas pemindahan.Tahap ekspresi FoxO1 dan p27 dalam sel yang ditransfeksi dengan perencat miR-21 dibandingkan dengan sel yang dirawat dengan eksosom terbitan BV2 menggunakan qRT-PCR (Rajah 6A, B).Pemindahan perencat miR-21 ke dalam sel U87 merendahkan ekspresi FoxO1 dan p27 dengan ketara (Rajah 6).
MiP-21 yang berasal dari exosomal BV2 yang dijangkiti RH mengubah ekspresi FoxO1/p27 dalam sel glioma U87.Sel U87 telah ditransfeksi dengan perencat miP-21 menggunakan Lipofectamine 2000 dan sel dituai 24 jam selepas pemindahan.Tahap ekspresi FoxO1 dan p27 dalam sel yang ditransfeksi dengan perencat miR-21 dibandingkan dengan tahap dalam sel yang dirawat dengan eksosom terbitan BV2 menggunakan qRT-PCR (A, B).
Untuk melarikan diri daripada tindak balas imun hos, parasit Toxoplasma berubah menjadi sista tisu.Mereka memparasit pelbagai tisu, termasuk otak, jantung, dan otot rangka, sepanjang hayat hos dan memodulasi tindak balas imun hos.Di samping itu, mereka boleh mengawal kitaran sel dan apoptosis sel tuan rumah, menggalakkan percambahan mereka14,24.Toxoplasma gondii kebanyakannya menjangkiti sel dendritik perumah, neutrofil, dan keturunan monosit/makrofaj, termasuk mikroglia otak.Toxoplasma gondii mendorong pembezaan makrofaj fenotip M2, menjejaskan penyembuhan luka selepas jangkitan patogen, dan juga dikaitkan dengan hipervaskularisasi dan fibrosis granulomatous.Patogenesis tingkah laku jangkitan Toxoplasma ini mungkin berkaitan dengan penanda yang berkaitan dengan perkembangan tumor.Persekitaran bermusuhan yang dikawal oleh Toxoplasma mungkin menyerupai prakanser yang sepadan.Oleh itu, boleh diandaikan bahawa jangkitan Toxoplasma harus menyumbang kepada perkembangan tumor otak.Malah, kadar jangkitan Toxoplasma yang tinggi telah dilaporkan dalam serum pesakit dengan pelbagai tumor otak.Selain itu, Toxoplasma gondii mungkin merupakan satu lagi kesan karsinogenik dan bertindak secara sinergistik untuk membantu karsinogen berjangkit lain mengembangkan tumor otak.Dalam hal ini, perlu diperhatikan bahawa virus P. falciparum dan Epstein-Barr secara sinergis menyumbang kepada pembentukan limfoma Burkitt.
Peranan eksosom sebagai pengawal selia dalam bidang penyelidikan kanser telah disiasat secara meluas.Walau bagaimanapun, peranan eksosom antara parasit dan perumah yang dijangkiti masih kurang difahami.Setakat ini, pelbagai pengawal selia, termasuk protein yang dirembeskan, telah menjelaskan proses biologi yang mana parasit protozoa menentang serangan perumah dan mengekalkan jangkitan.Baru-baru ini, terdapat konsep yang semakin berkembang bahawa mikrovesikel yang berkaitan dengan protozoa dan mikroRNA mereka berinteraksi dengan sel hos untuk mewujudkan persekitaran yang baik untuk kelangsungan hidup mereka.Oleh itu, kajian lanjut diperlukan untuk menemui hubungan antara miRNA eksosomal yang diubah dan percambahan sel glioma.Pengubahan mikroRNA (gen kluster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 dan miR-17-92) mengikat kepada promoter STAT3 dalam makrofaj manusia yang dijangkiti toxoplasma, dikawal dan mendorong anti -apoptosis sebagai tindak balas kepada jangkitan Toxoplasma gondii 29 .Jangkitan toksoplasma meningkatkan ekspresi miR-17-5p dan miR-106b-5p, yang dikaitkan dengan beberapa penyakit hiperproliferatif 30 .Data ini mencadangkan bahawa miRNA hos yang dikawal oleh jangkitan Toxoplasma adalah molekul penting untuk survival parasit dan patogenesis dalam tingkah laku biologi tuan rumah.
MiRNA yang diubah boleh mempengaruhi pelbagai jenis tingkah laku semasa permulaan dan perkembangan sel malignan, termasuk glioma: sara diri isyarat pertumbuhan, ketidakpekaan terhadap isyarat menghalang pertumbuhan, pengelakan apoptosis, potensi replika tanpa had, angiogenesis, pencerobohan dan metastasis, dan keradangan.Dalam glioma, miRNA yang diubah telah dikenal pasti dalam beberapa kajian profil ekspresi.
Dalam kajian ini, kami mengesahkan tahap tinggi ekspresi miRNA-21 dalam sel hos yang dijangkiti toxoplasma.miR-21 telah dikenal pasti sebagai salah satu mikroRNA yang paling kerap diekspresikan dalam tumor pepejal, termasuk glioma, 33 dan ekspresinya berkorelasi dengan gred glioma.Bukti terkumpul menunjukkan bahawa miR-21 ialah onkogen baru yang bertindak sebagai faktor anti-apoptosis dalam pertumbuhan glioma dan sangat tertekan dalam tisu dan plasma keganasan otak manusia.Menariknya, ketidakaktifan miR-21 dalam sel dan tisu glioma mencetuskan perencatan percambahan sel akibat apoptosis yang bergantung kepada caspase.Analisis bioinformatik sasaran miR-21 yang diramalkan mendedahkan pelbagai gen penindas tumor yang dikaitkan dengan laluan apoptosis, termasuk kematian sel terprogram 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, dan kotak forkhead O1 (FoxO1), dengan tapak pengikat miR-2121..22.38.
FoxO1, sebagai salah satu faktor transkripsi (FoxO), terlibat dalam pembangunan pelbagai jenis kanser manusia dan boleh mengawal ekspresi gen penindas tumor seperti p21, p27, Bim, dan FasL40.FoxO1 boleh mengikat dan mengaktifkan perencat kitaran sel seperti p27 untuk menyekat pertumbuhan sel.Selain itu, FoxO1 ialah pengesan utama isyarat PI3K/Akt dan mengawal banyak proses biologi seperti perkembangan kitaran sel dan pembezaan sel melalui pengaktifan transkripsi p2742.
Kesimpulannya, kami percaya bahawa miR-21 eksosomal yang diperoleh daripada mikroglia yang dijangkiti Toxoplasma mungkin memainkan peranan penting sebagai pengawal selia pertumbuhan sel glioma (Rajah 7).Walau bagaimanapun, kajian lanjut diperlukan untuk mencari hubungan langsung antara exosomal miR-21, jangkitan Toxoplasma yang diubah, dan pertumbuhan glioma.Keputusan ini dijangka memberikan titik permulaan untuk mengkaji hubungan antara jangkitan Toxoplasma dan kejadian glioma.
Gambarajah skematik mekanisme karsinogenesis glioma (otak) dicadangkan dalam kajian ini.Penulis melukis dalam PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Semua protokol eksperimen dalam kajian ini, termasuk penggunaan haiwan, adalah mengikut Garis Panduan Etika Standard Penjagaan Haiwan Universiti Kebangsaan Seoul dan Jawatankuasa Pengguna dan telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Sekolah Perubatan Universiti Kebangsaan Seoul (nombor IRB SNU- 150715).-2).Semua prosedur eksperimen telah dijalankan mengikut cadangan ARRIVE.
Mikroglia tikus BV2 dan sel glioma manusia U87 telah dibiakkan dalam Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) dan Medium Institut Memorial Roswell Park (RPMI; Welgene), masing-masing mengandungi 10% serum lembu janin, 4 mM l- glutamin, 0.2 mM penisilin dan 0.05 mM streptomycin.Sel telah dibiakkan dalam inkubator dengan 5% CO2 pada suhu 37°C.Satu lagi barisan sel glioma, U118, digunakan untuk perbandingan dengan sel U87.
Untuk mengasingkan eksosom daripada strain RH dan ME49 yang dijangkiti T. gondii, T. gondii tachyzoites (strain RH) telah dituai daripada rongga perut tikus BALB/c berusia 6 minggu yang disuntik 3-4 hari sebelumnya.Tachyzoit dibasuh tiga kali dengan PBS dan disucikan dengan sentrifugasi dalam 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Untuk mendapatkan tachyzoit strain ME49, tikus BALB/c disuntik secara intraperitoneal dengan 20 sista tisu dan transformasi tachyzoit dalam sista dikumpulkan dengan membasuh rongga perut pada hari ke-6-8 selepas jangkitan (PI).Tikus dijangkiti PBS.ME49 tachyzoit ditanam dalam sel yang ditambah dengan 100 μg / ml penisilin (Gibco / BRL, Grand Island, NY, Amerika Syarikat), 100 μg / ml streptomycin (Gibco / BRL), dan 5% serum lembu janin (Lonza, Walkersville, MD) .., Amerika Syarikat) pada 37 °C dan 5% karbon dioksida.Selepas penanaman dalam sel Vero, tachyzoit ME49 disalurkan dua kali melalui jarum tolok 25 dan kemudian melalui penapis 5 µm untuk membuang serpihan dan sel.Selepas mencuci, tachyzoit digantung semula dalam PBS44.Sista tisu strain Toxoplasma gondii ME49 dikekalkan melalui suntikan intraperitoneal sista yang diasingkan daripada otak tikus C57BL/6 yang dijangkiti (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Otak tikus yang dijangkiti ME49 dituai selepas 3 bulan PI dan dicincang di bawah mikroskop untuk mengasingkan sista.Tikus yang dijangkiti disimpan dalam keadaan bebas patogen (SPF) khas di Sekolah Perubatan Universiti Kebangsaan Seoul.
Jumlah RNA diekstrak daripada eksosom terbitan BV2, sel BV2 dan tisu menggunakan Kit Mini miRNeasy (Qiagen, Hilden, Jerman) mengikut arahan pengilang, termasuk masa pengeraman untuk langkah elusi.Kepekatan RNA ditentukan pada spektrofotometer NanoDrop 2000.Kualiti microarrays RNA dinilai menggunakan bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Belanda).
DMEM dengan 10% exosome-poor FBS telah disediakan dengan ultracentrifugation pada 100,000g selama 16 jam pada 4°C dan ditapis melalui penapis 0.22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Sel BV2, 5 × 105, telah dibiakkan dalam DMEM yang mengandungi 10% FBS exosome-depleted dan 1% antibiotik pada 37 ° C dan 5% CO2.Selepas 24 jam pengeraman, tachyzoit strain RH atau ME49 (MOI = 10) telah ditambah ke dalam sel dan parasit yang tidak menyerang telah dikeluarkan dalam masa sejam dan diisi semula dengan DMEM.Eksosom daripada sel BV2 telah diasingkan dengan sentrifugasi pembezaan yang diubah suai, kaedah yang paling banyak digunakan.Gantung semula pelet eksosom dalam 300 µl PBS untuk analisis RNA atau protein.Kepekatan eksosom terpencil ditentukan menggunakan kit ujian protein BCA (Pierce, Rockford, IL, Amerika Syarikat) dan spektrofotometer NanoDrop 2000.
Mendakan daripada sel BV2 atau eksosom yang diperoleh daripada BV2 telah dilisekan dalam larutan pengekstrakan protein PRO-PREP™ (Bioteknologi iNtRon, Seongnam, Korea) dan protein telah dimuatkan ke dalam gel poliakrilamida 10% SDS berwarna biru cemerlang Coomassie.Di samping itu, protein dipindahkan ke membran PVDF selama 2 jam.Western blots telah disahkan menggunakan antibodi Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) sebagai penanda eksosomal.IgG (H + L) kambing konjugasi HRP (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) dan penganalisis imej bercahaya LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Jepun) digunakan sebagai antibodi sekunder..Mikroskopi elektron penghantaran dilakukan untuk mengkaji saiz dan morfologi eksosom.Eksosom yang diasingkan daripada sel BV2 (6.40 µg/µl) disediakan pada jerat bersalut karbon dan diwarnakan secara negatif dengan 2% uranil asetat selama 1 minit.Sampel yang disediakan telah diperhatikan pada voltan pecutan 80 kV menggunakan JEOL 1200-EX II (Tokyo, Jepun) yang dilengkapi dengan kamera CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, CA, Amerika Syarikat).
Eksosom yang diperolehi BV2 telah diwarnakan menggunakan Kit Penghubung Pendarfluor Merah PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 15 minit pada suhu bilik.Sel U87, 2×105, dengan eksosom berlabel PKH26 (merah) atau tiada eksosom sebagai kawalan negatif, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator CO2 5%.Nukleus sel U87 telah diwarnai dengan DAPI (biru), sel U87 telah ditetapkan dalam 4% paraformaldehid selama 15 minit pada 4 ° C dan kemudian dianalisis dalam sistem mikroskop confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Jerman).boleh diperhatikan.
cDNA telah disintesis daripada siRNA menggunakan sintesis helai pertama Mir-X siRNA dan kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Jepun).PCR kuantitatif masa nyata dilakukan menggunakan sistem pengesanan PCR masa nyata iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) menggunakan primer dan templat yang dicampur dengan SYBR Premix.DNA telah dikuatkan untuk 40 kitaran denaturasi pada 95 ° C selama 15 s dan penyepuhlindapan pada 60 ° C selama 60 s.Data daripada setiap tindak balas PCR dianalisis menggunakan modul analisis data perisian sistem optik iQ™5 (Bio-Rad).Perubahan relatif dalam ekspresi gen antara gen sasaran terpilih dan β-actin/siRNA (dan U6) dikira menggunakan kaedah lengkung piawai.Urutan primer yang digunakan ditunjukkan dalam Jadual 1.
3 x 104 sel glioma U87 telah disemai dalam plat 96-telaga dan dicampur dengan eksosom yang dijangkiti Toxoplasma yang diperoleh daripada BV2 (50 μg/mL) atau eksosom bukan nadi yang diperoleh daripada BV2 (50 μg/mL) sebagai kawalan pada 12, 18 dan 36 jam .Kadar percambahan sel ditentukan menggunakan Kit Pengiraan Sel-8 (Dojindo, Kumamoto, Jepun) (Angka Tambahan S1-S3) 46 .
Tikus bogel BALB/c betina berusia 5 minggu telah dibeli dari Orient Bio (Seongnam-si, Korea Selatan) dan disimpan secara individu dalam sangkar steril pada suhu bilik (22±2°C) dan kelembapan (45±15°C).%) pada suhu bilik (22±2°C) dan kelembapan (45±15%).Kitaran cahaya 12 jam dan kitaran gelap 12 jam telah dilakukan di bawah SPF (Pusat Haiwan Sekolah Perubatan Universiti Kebangsaan Seoul).Tikus dibahagikan secara rawak kepada tiga kumpulan 5 tikus setiap satu dan semua kumpulan disuntik secara subkutan dengan 400 ml PBS yang mengandungi 1 x 107 sel glioma U87 dan faktor pertumbuhan mengurangkan BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Enam hari selepas suntikan tumor, 200 mg eksosom yang diperoleh daripada sel BV2 (dengan/tanpa jangkitan Toxoplasma) disuntik ke dalam tapak tumor.Dua puluh dua hari selepas jangkitan tumor, saiz tumor tikus dalam setiap kumpulan diukur dengan caliper tiga kali seminggu, dan jumlah tumor dikira dengan formula: 0.5 × (lebar) × 2 × panjang.
Analisis ekspresi mikroRNA menggunakan tatasusunan miRNA LNA miRCURYTM, tatasusunan mmu dan rno generasi ke-7 (EXIQON, Vedbaek, Denmark) meliputi 1119 tikus yang dicirikan dengan baik dalam kalangan 3100 probe tangkapan miRNA manusia, tetikus dan tikus.Semasa prosedur ini, 250 hingga 1000 ng jumlah RNA telah dikeluarkan daripada 5'-fosfat dengan rawatan dengan fosfatase alkali usus anak lembu diikuti dengan pelabelan dengan pewarna pendarfluor hijau Hy3.Sampel berlabel kemudiannya dihibridkan dengan memuatkan slaid microarray menggunakan kit ruang hibridisasi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Amerika Syarikat) dan kit slaid hibridisasi (Agilent Technologies).Hibridisasi telah dijalankan selama 16 jam pada suhu 56°C, kemudian susunan mikro dicuci mengikut saranan pengilang.Slaid microarray yang diproses kemudiannya diimbas menggunakan sistem pengimbas microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Imej yang diimbas telah diimport menggunakan perisian Agilent Feature Extraction versi 10.7.3.1 (Agilent Technologies) dan keamatan pendarfluor setiap imej dikira menggunakan fail GAL yang sepadan bagi protokol Exiqon yang diubah suai.Data microarray untuk kajian semasa disimpan dalam pangkalan data GEO di bawah nombor penyertaan GPL32397.
Profil ekspresi miRNA eksosomal matang dalam mikroglia RH atau ME49 strain yang dijangkiti Toxoplasma dianalisis menggunakan pelbagai alat rangkaian.miRNA yang dikaitkan dengan perkembangan tumor telah dikenal pasti menggunakan miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) dan ditapis dengan keamatan isyarat normal (log2) lebih daripada 8.0.Antara miRNA, miRNA yang dinyatakan secara berbeza didapati lebih daripada 1.5 kali ganda diubah oleh analisis penapis miRNA yang diubah oleh strain RH atau ME49 yang dijangkiti T. gondii.
Sel telah disemai dalam plat enam telaga (3 x 105 sel / telaga) dalam opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) menggunakan Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat).Sel-sel yang ditransfeksi dibiakkan selama 6 jam dan kemudian medium ditukar kepada medium lengkap segar.Sel dituai 24 jam selepas pemindahan.
Analisis statistik dilakukan terutamanya menggunakan ujian-t Pelajar dengan perisian Excel (Microsoft, Washington, DC, Amerika Syarikat).Untuk analisis haiwan eksperimen, ANOVA dua hala dilakukan menggunakan perisian Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Nilai-P <0.05 dianggap sebagai signifikan secara statistik. Nilai-P <0.05 dianggap sebagai signifikan secara statistik. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0.05 dianggap signifikan secara statistik. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0.05 dianggap signifikan secara statistik.
Semua protokol eksperimen yang digunakan dalam kajian ini telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Sekolah Perubatan Universiti Kebangsaan Seoul (nombor IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Anggaran kejadian dan kematian kanser global pada 2018: Sumber dan kaedah GLOBOCAN.Tafsiran.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Satu pandangan tentang faktor risiko tumor otak dan campur tangan terapeutik mereka. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Satu pandangan tentang faktor risiko tumor otak dan campur tangan terapeutik mereka.Rashid, S., Rehman, K. dan Akash, MS Kajian semula faktor risiko untuk tumor otak dan campur tangan terapeutik utama. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pemahaman mendalam tentang faktor risiko tumor otak dan campur tangan terapeutik.Rashid, S., Rehman, K. dan Akash, MS Kajian semula faktor risiko untuk tumor otak dan campur tangan terapeutik utama.Sains bioperubatan.Ahli farmasi.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteria-virus dalam orodigestive manusia dan kanser saluran genital wanita: Ringkasan bukti epidemiologi dan makmal. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteria-virus dalam orodigestive manusia dan kanser saluran genital wanita: Ringkasan bukti epidemiologi dan makmal.Kato I., Zhang J. dan Sun J. Interaksi bakteria-virus dalam kanser saluran gastrousus manusia dan saluran genital wanita: ringkasan data epidemiologi dan makmal. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteria-virus dalam pencernaan rongga mulut manusia dan saluran pembiakan wanita: ringkasan sains penyakit popular dan bukti makmal.Kato I., Zhang J. dan Sun J. Interaksi bakteria-virus dalam kanser gastrousus manusia dan kanser alat kelamin wanita: ringkasan data epidemiologi dan makmal.Kanser 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Daripada jangkitan kepada kanser: Bagaimana virus tumor DNA mengubah karbon pusat sel perumah dan metabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL Daripada jangkitan kepada kanser: Bagaimana virus tumor DNA mengubah karbon pusat sel perumah dan metabolisme lipid.Mahon, KL dan Parish, JL Jangkitan kebakaran kepada kanser: bagaimana virus tumor berasaskan DNA mengubah karbon pusat sel perumah dan metabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Daripada jangkitan kepada kanser: bagaimana virus tumor DNA mengubah karbon pusat sel perumah dan metabolisme lipid.Mahon, KL dan Parish, JL Membakar jangkitan kepada kanser: bagaimana virus tumor DNA mengubah karbon pusat dan metabolisme lipid dalam sel perumah.Biologi Terbuka.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Estrogen katekol daripada schistosoma dan cacing hati dan kanser yang berkaitan dengan helmin.depan.panas dalam.5, 444 (2014).